三氧化二砷对mrllpr狼疮小鼠脾脏cd4+t细胞ifn-和il-4基因启动子甲基化的影响

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1、三氧化二砷对MRL/lpr狼疮小鼠脾脏CD4+T细胞IFN-和IL-4基因启动子甲基化的影响朱载华浙江省人民医院朱小春教授温州医学院附属第一医院研究背景系统性红斑狼疮病因发病机制未明多器官、多系统受累激素、免疫抑制剂治疗为主大量自身抗体产生系统性红斑狼疮系统性红斑狼疮发病机制SLET、B细胞的过度活化T细胞DNA呈低甲基化DNA甲基化酶的活性下降自身抗体、免疫复合物形成IFN-和IL-4明显升高系统性红斑狼疮发病机制目前认为，DNA甲基化和组蛋白乙酰化等表观遗传学机制在系统性红斑狼疮的发病机制中起重要作用。三氧化二砷（ATO）的临床应用我国自1992年率先采用亚砷酸治疗急性早幼粒细胞

2、白血病获得成功，缓解率高，副作用小。美国FDA于2000年批准ATO注射液上市作为复发性急性早幼粒细胞白血病的二线治疗药物。LeoniF,GianfaldoniG,AnnunziataM,etal.Arsenictrioxidetherapyforrelapsedacutepromyelocyticleukemia:abridgetotransplantation[J].Haematologica,2002,87(5):485-489.ATO研究进展ATO能通过改变DNA甲基化水平来影响、调控基因的转录。如：促进多种肿瘤基因（bcl-2、p53、p16等）启动子的甲基化。2006年法国学者

3、PierreBobé等在《BLOOD》杂志上发表论文提出ATO对狼疮鼠有治疗作用。BobeP,BonardelleD,BenihoudK,etal.Arsenictrioxide:ApromisingnoveltherapeuticagentforlymphoproliferativeandautoimmunesyndromesinMRL/lprmice[J].Blood,2006,108(13):3967-3975.本课题组研究基础体内研究ATO对BXSB狼疮小鼠有免疫抑制作用体内研究ATO能降低发病早、晚期的MRL/lpr小鼠血清抗ds-DNA抗体、IFN-和IL-4的水平体外研究A

4、TO能抑制MRL/lpr狼疮鼠CD4+T细胞的增殖，降低其IFN-和IL-4的基因转录和翻译水平ATO能提高MRL/lpr狼疮鼠脾脏及淋巴结的DNA甲基化水平体内研究研究目的研究目的MRL/lpr狼疮小鼠和C57小鼠脾脏CD4+T细胞IFN-和IL-4基因启动子甲基化的对比；观察ATO对MRL/lpr狼疮小鼠脾脏CD4+T细胞IFN-和IL-4基因启动子甲基化的影响；探讨ATO对SLE的治疗机制，及其逆转MRL/lpr狼疮小鼠IFN-和IL-4基因启动子低甲基化之间的关系。实验方法动物模型MRL/lpr小鼠，含有与细胞凋亡有关的Fas基因隐性突变，症状与人类红斑狼疮相似，包括显著的

5、血清自身抗体、免疫复合物肾小球肾炎、血管炎等。其发病年龄约为10-12周。Santiago-RaberML,LaporteC,ReiningerL,etal.Geneticbasisofmurinelupus[J].AutoimmunRev.2004,3(1):33-39.MizugakiM,YamaguchiT,IshiwataS,etal.AlterationofDNAmethylationlevelsinMRLlupusmice[J].ClinExpImmunol.1997,110(2):265-269.SawalhaAH,JeffriesM.DefectiveDNAmethylat

6、ionandCD70overexpressioninCD4+TcellsinMRL/lprlupus-pronemice[J].EurJImmunol.2007,37(3):1407-1413.实验分组（n=20）①PBS组：空白对照②ATO组：1.0mol/LATO③5-AZA+ATO组：1.0mol/L5-AZA+1.0mol/LATO实验路线图PBS组CD4+T细胞IFN-和IL-4基因启动子甲基化水平测定C57BL/6J小鼠脾细胞MRL/lpr小鼠脾细胞ATO组5-AZA+ATO组DNA抽提实验方法--CD4+T细胞的分离和培养1小鼠脾脏淋巴细胞分离:密度梯度离心法3细胞活

7、力检测:台盼兰拒染法2CD4+T细胞分选：免疫磁珠法4CD4+T细胞培养：PHA-p和IL-2常规刺激；体外诱导48小时后进行分组。实验方法--基因启动子甲基化水平测定CD4+T细胞基因组DNA抽提；DNA亚硫酸氢盐修饰；PCR扩增IFN-和IL-4基因启动子；CpG岛中非甲基化CUT；CpG岛中甲基化mCCCCpG岛以外序列中的CUT。DNA凝胶回收；TA克隆构建克隆载体；抗性及蓝白斑筛选获得阳性克隆子；原位PCR鉴