线粒体钙单向转运体在二氮嗪抗脑缺血再灌注性损伤中的作用

《线粒体钙单向转运体在二氮嗪抗脑缺血再灌注性损伤中的作用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、青岛大学硕士学位论文1．1实验材料1．1．1实验动物第一章材料与方法健康雄性Wistar大鼠150只，普通级，体质量2209一2809，山东济宁鲁抗有限公司提供。1．1．2主要仪器显微镜，Leica，德国。分光光度计，UV一1240，日本。Shandon325型石蜡切片机，英国Shandon公司CS-IV型摊片烤片机，湖北孝感宏业医用仪器公司PYX-DHS-40型电热恒温培养箱，上海跃进医用仪器厂超低温冰箱，Eppendorf，美国电子天平，Cryostar，美国磁力搅拌器，上海浦江分析仪器厂1．1．3主要试剂的来源和配制(1)试剂盒：TUNEL细胞凋亡检测试剂盒、Bax羊抗大鼠多克隆

2、抗体、CytC兔抗大鼠多克隆抗体均由北京中杉金桥生物工程有限公司提供；超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒，丙二醛(MDA)测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH—Px)试剂盒、一氧化氮(NO)试剂盒、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒、牛血清白蛋白均由南京建成生物工程研究所提供；线粒体提取试剂盒与线粒体裂解液由上海杰美基因医药科技有限公司提供；Western及IP细胞裂解液、BCA蛋白试剂盒、Fura一2舢探针均由碧云天生物有限公司提供。(2)1％红四氮唑(TTC)配置：用lOOml0．2MPBS稀释lgTTC粉，保存条件4"C，避光。(3)50％，70％，85％，95％，100％梯度酒精。(4

3、)二甲苯。(5)切片石蜡。(6)氨水。2第一章材料与方法(7)中性树胶。(8)直径0．235mm鱼线。(9)Tris—HCl，TritonX一100，CaCl2．(10)线粒体呼吸介质(pH7．2)：300mmol／1甘露醇，lOmmol／LKH。PO,，lOmmol／LKCL，5mmol／LMgCl。用Tris—HCl调节pH。．(11)线粒体测试介质(pH7．0)：120mmol／LKCl，lOmmol／LMOPS，5mmol／L谷氨酸，5mmol／L苹果酸，用Tris-HCl调节pH。(12)二氮嗪，精胺由Sigma公司提供。1．2实验方法1．2．1实验分组健康雄性Wistar大

4、鼠100只按照完全随机方法分为5组：A组，手术操作与模型组相似，插入线栓深度约lOmm；B组，单纯行大脑中动脉阻塞(middlecerebralarteryocclusion，MCAO)后再灌注模型；C组，行MCAO前30min腹腔注射二氮嗪lOmg／kg；D组，行MCAO前30min腹腔注射二氮嗪lOmg／kg，并且于再灌注前lOmin腹腔注射精胺lOmg／kg；E组，再灌注前lOmin腹腔注射精胺lOmg／kg。1．2．2动物模型制作所有大鼠术前均禁食12h，不禁水。10％水合氯醛(0．35ml／kg)腹腔注射麻醉。术中白炽灯照射保持动物直肠温度为36．5"C’37．O'C。根据L

5、onga等的方法改良后应用0．26mm或0．285mm渔线建立短暂局部MCAO模型。大鼠仰卧固定在手术台上，行颈部正中切口，仔细分离左侧颈总动脉(CCA)，放两根丝线备用；分离并结扎颈外动脉(ECA)；分离颈内动脉(ICA)，并用小型动脉夹暂时夹闭。一根丝线结扎CCA近端，在CCA结扎远端剪一小v型口，经此小口插入头端圆钝经肝素处理的渔线，越过分叉处后用丝线轻轻系紧，松开ICA处动脉夹，渔线通过ICA入颅到达大脑前动脉起始部，以阻断大脑中动脉血流。插入深度约为(19．0+0．5)mm，直至感到轻微阻力，将备用丝线打结系紧防止渔线脱出，缝合皮肤。模型成功的标志是出现偏瘫症状。A组动物栓线

6、插入仅约10．Om，余步骤相同。术后动物单独放入笼中，苏醒期间注意保温。缺血2h后将线栓轻轻拔出约]Omm进行大脑中动脉缺血后再灌注，24h后观察大鼠行为学改变，均行冰上断头取脑。1．2．3神经功能学评分3青岛大学硕士学位论文术前及MCAO2h再灌注24h后，按照GarciaJH晦3所描述的观察方法进行神经功能学评分。评估的指标包括自主活动的多少，四肢活动协调性的程度，前趾能否伸展及其能力，攀爬能力，肢体对刺激的反应，触须反应。各项指标每项评分为卜3分或0-3分，总分为0-18分。评分分值越低代表神经精神功能损伤越大，正常大鼠评分为18分。具体评分方法如下：(1)自主活动：将大鼠放入鼠

7、笼中，观察5min。3分一大鼠探查其所在环境，并靠近至少3个壁；2分一大鼠活动减少，可靠近一个笼壁；1分一大鼠不站起，很少活动；0分一大鼠不活动。(2)四肢活动的协调性：提起大鼠尾部，观察四肢伸展是否对称。3分一四肢伸展对称；2分一右侧肢体伸展相对左侧少或慢；1分一右侧肢体活动一点；0分一右侧肢体一点不活动。(3)前趾伸展能力：提起大鼠尾部，让其用前趾爬行，观察前趾伸展能力。3分一双前趾伸展对称；2分一右侧前趾伸展能力降低；1分一右侧前趾伸展能