线粒体钙单向转运体对大鼠脑缺血再灌注损伤中线粒体能量代谢与细胞凋亡的影响

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1、青岛大学硕士学位论文1．1实验材料1．1．1实验动物第一章材料与方法健康雄性Wistar大鼠100只，普通级，体质量2209一2809，青岛市药检所提供。1．1．2主要仪器显微镜Leica，德国。Safire2高速多通道连续波长酶标仪Tecan，瑞士低温高速离心机HealForce，美国流式细胞仪BeckmanCoulter，美国Shandon325型石蜡切片机英国Shandon公司PYX-DHS-40型电热恒温培养箱上海跃进医用仪器厂超低温冰箱Eppendorf，美国电子天平Cryostar，美国1．1．3主要试剂的来源和配制(1)试剂盒：TUNEL细胞凋亡检测

2、试剂盒由北京中杉金桥生物工程有限公司提供；线粒体提取试剂盒，活体组织氧化应激活性氧(ROS)初级荧光测定试剂盒和线粒体酶复合体活性检测试剂盒由上海杰美基因医药科技有限公司提供；考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒、牛血清白蛋白均由南京建成生物工程研究所提供；ATP含量检测试剂盒由碧云天生物有限公司提供。(2)直径0．265mm鱼线。(3)肝素(4)2，3，5氧化三苯基四氮唑(TTC，北京索莱宝科技有限公司)配置：用lOOml0．2MPBS稀释lgTTC粉，保存条件4V，避光。(5)切片石蜡。(6)二甲苯。(7)氨水。(8)中性树胶。(9)钌红(rutheniumred，RR)

3、(美国Sigma公司)。2第一章材料与方法(10)精胺(spermine，Sper)(美[]Sigma公司)(11)罗丹明123(Rhodamine123，)(美国Sigma公司)，1．2实验方法1．2．1实验分组健康雄，[1Wistar大鼠48只按照完全随机方法分为4组：假手术组(sham)：仅剥离颈总、颈内及颈外动脉而不结扎；脑缺血再灌注组(I／R)：制作大脑中动脉梗塞模型，缺血2h后再灌注24h；脑缺血再灌注复合钌红组(ischemia／reperfusion+rutheniumred，I／R+RR)：脑缺血30min之前预先股静脉注射钌红(2．5mg／kg

4、)，缺血2h后再灌注24h；脑缺血再灌注复合精胺组(ischemia／reperfusion+spermine，I／R+Sper)：脑缺血30min之前预先股静脉注射精胺(5mg／kg)，缺血2h后再灌注24h。1．2．2动物模型制作术前禁食12h，禁水4h。腹腔注射lO％水合氯醛(O．35ml／100g)麻醉。采用线栓法n33改良后制备大脑中动脉梗塞模型。大鼠仰卧固定在手术台上，颈正中切口，暴露、剥离颈总、颈外动脉及颈内动脉，结扎颈总、颈外动脉，并用动脉夹夹闭颈内动脉。于颈内颈外动脉分叉下方5mE处剪一切口，将预先制作好的前端蘸腊、经肝素浸泡过的鱼线，轻柔地置入

5、颈内动脉，松开动脉夹，直至大脑前动脉近端，深度约20±0．5mE，有轻微阻力感为止。固定好鱼线并缝合伤口。2h后鱼线抽出lcm以恢复再灌注。手术过程中，用电烤灯维持大鼠肛温在(37---37．5)℃。假手术组动物栓线插入仅约lO．Omm，余步骤相同。再灌注24h后观察大鼠行为学改变，将大鼠麻醉，冰上断头取脑。1．2．3脑梗死面积百分比测定24h后快速冰上断头取脑，去除嗅球、小脑等，置于一20℃冰箱内保存lOmin，便于切片。将脑置于特定的脑模具上进行切片，宽度为2mm．将切片迅速放入1％的TTC溶液(PBS溶解)中，37"C温箱避光孵育15min。正常脑组织呈红色

6、，梗死区脑组织呈现苍白色。将染好的脑切片按顺序放到载玻片上，数码相机进行拍照，采用ImageProPlus6．0图像分析系统进行分析，计算梗死面积占总面积的百分比。1．2．4脑组织取材3青岛大学硕士学位论文再灌注24h后，大鼠经腹腔注射10％水合氯醛(0．5ml／lOOg)麻醉，仰卧固定于手术台上，迅速打开腹腔并暴露隔肌，剪开膈肌后暴露心脏，然后迅速剪开胸骨，并用眼科剪打开心包，注意不要损伤心脏及大血管。从心尖处插入灌流针，打开输液器，在右心耳处剪--d,孑L。先用100-200ml的0．2MPBS进行灌注，待冲洗液颜色变为透明时改用4％多聚甲醛灌注，速度先快后慢

7、，灌注时看到大鼠肢体抽搐，证明效果佳。待大鼠全身僵硬后，断头取脑，注意尽量保持脑组织完整。脑组织取出后放入4％多聚甲醛固定24h，30％蔗糖脱水，石蜡包埋，切片。1．2．5TUNEL法检测细胞凋亡(1)组织切片按常规方法进行烘干、脱蜡及水合。(2)自来水，蒸馏水各5min，擦干。画圈吹干lOmin，过PBS，擦干。(3)滴!JH50ul不含DNase的蛋白酶K，37℃作用15min。(4)PBS洗涤3次*5min，滤纸吸干周围液体，尽量将PBS除去干净。(5)滴jJNTUNEL反应液50ul，放入37。C湿盒，2h。阴性对照组仅滴加标记液50ul，阳性对照组滴jJ

8、NDnas