线粒体钙单向转运体对线粒体通透性转换孔的调控作用

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1、学位论文独创性声明、学位论文知识产权权属声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．31引言近年来，随着人们生活水平的提高脑血管病的发病率越来越高，在相关疾病的诊疗过程中，缺血再灌注损伤是重要的病理生理过程。1977年，Hearse首次提出缺血再灌注损伤(Ischemiareperfusioninjury，IR／I)的概念。所谓IR／I是指细胞因缺血发生可逆性、可存活的损伤，在缺血纠正后这种损伤反而加重并引起细胞死亡或进一步的功能障碍Ⅲ。脑是发生IR／I最常见的组织之一，其导致的迟发性神经元损伤，严重影响患者的预后和功能恢复。脑缺血再灌注能触发一系列的复杂的级联反映，包括线粒体功能障碍，A

2、TP生成减少，Na+一K+泵功能障碍，Ca2+通道病理性开放，导致细胞内钙超载、自由基产生、兴奋性氨基酸增加、N0缺失、激活内质网应激反应等一系列病理事件，最终导致神经元细胞的变性和凋亡。在这一病理过程中，线粒体的通透性转变起着重要的作用‘21。线粒体是多种促细胞凋亡转导分子的靶点，也是细胞死亡通路的整合元件n1。研究表明，线粒体的功能障碍和线粒体通透性转换孔(mitochondrialpermeabilitytransitionpore，mPTP)密切相关。nlPTP的开放与脑缺血再灌注损伤关系密切u1。～般认为mPTP是由线粒体膜上多蛋白组成的非选择性复合孔道，其主要由外膜

3、的电压依赖性阴离子通道(VDAC)，内膜的腺苷酸转位子(ANT)，基质的亲环蛋白D(CyP-D)，及其他的蛋白如苯二氮卓类受体(BdR)、已糖激酶(HK)和肌酸激酶(CK)组成。VDAC对于保持线粒体外膜对代谢物的通透性非常重要，比如ATP、ADP，此夕bVDAC也参与了线粒体内膜间隙中蛋白的释放，在细胞凋亡和死亡中起到重要作用。ANT通过改变线粒体的能量代谢作用于InPTP的开放。CyP-D是免疫抑制剂亲环素(cyclos-porinA，CsA)在细胞内的结合蛋白，是一种与蛋白质合成后折叠和输送有关的肽脯氨酰顺反异构酶(PPIase)。其他构成部分可能主要起到调节作用¨一1。

4、mPTP的开放可发生在缺血再灌注的各个阶段，诱发mPTP开放的因素较多，胞浆和线粒体基质Ca2+增加、自由基、神经酰胺和神经节苷脂、线粒体跨膜电位降低、能量衰竭等。其中Ca2+和活性氧自由墓对InPTP的开放影响最大。有学者将mPTP描述为是Ca2+诱导的Ca2+释放(CICR)通道，因为随着线粒体基质Ca2+的积聚，触发mPTP开放，A1lrm下降导致快速的Ca2+内流，进而引起cd+通过肌浆网Ryanodine受体和内质网IP3受体进一步释放。Ca2+通过与InPTP的VDAC直接作用，使IllPTP对Ca2+的激活作用更敏感，同时细胞通过吸收Ca2+引起N0合酶(NOS)

5、被激活，在线粒体内形成过氧化物，改变线粒体膜的结构‘71。胞浆中的Ca2+是一种有效的诱导lIlPTP开放的诱导剂。超过生理剂量(≥10pmol／L)的Ca2+足以引起IIlPTP开放，在低剂量时它可以促进其他促凋亡因子的效应。因此，增加游离Ca2+对诱导细胞凋亡十分重要‘81。线粒体内膜上还存在着两种重要的Ca2+转运体，一种是线粒体钙单向转运体】引言(mitochondrialcalciumuniporter，MCU)，一种是Na+／Ca2+交换体，他们都可以介导线粒体基质中Ca2+的转运。然而研究表明，Na+／Ca2+交换体在缺血再灌注损伤中作用很小，MCU在脑缺血再灌注

6、损伤中发挥了重要的脑保护作用‘91。mPTP和MCU都介导线粒体Ca2+转运体系且都与缺血／再灌注损伤(I／RI)有关，那么二者是否存在一定的调节关系进而发挥保护作用，目前国内外的相关研究较少。因此，我们的研究设计了检NMCU与mPTP之间的调控关系，以及探讨了这种调控关系在脑缺血再灌注损伤中的作用。本研究选取新生大鼠(出生24h内)为研究对象，采用原代培养大鼠海马神经元的技术，利用荧光显微镜免疫荧光技术进行海马神经元纯度的鉴定；利用荧光分光光度计进行了预处理组海马神经元细胞的抑制率检测：加入大剂量Ca2+，模拟缺血再灌注过程，建立钙超载模型，利用激光共聚焦显微镜持续监测不同处

7、理组线粒体内calceinAM的荧光强度变化探讨了MCU对mPTP的调控作用。2第一章材料和方法1．1工具药精胺(spermine，Sper)lg批号：$3256Sigma公司美国；环孢菌素(ciclosporinA，CsA)5mg批号：C3662Sigma公司美国；苍术甙(atractyloside，Atr)250mg批号：A6882Sigma公司美国；Ru3600．1mg批号：557440Merk公司德国1．2海马神经元的原代培养1．2．1动物选择新生wistar大鼠(出生24h内)，由