dhv-ⅰ单克隆抗体的制备与胶体金试纸条的研制

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1、3．11单抗的纯化与鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3．12胶体金标记抗体最低稳定量的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3．13金标抗体吸附于玻璃纤维⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3．14NC膜包被单抗和二抗⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3．15样品垫的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3．16最适标记金颗粒大小的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3．17免疫层析试纸条性能的测试⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4．1DHv_IVPI的表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4．2小鼠的免疫⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯574．3建立筛选方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯584．4细胞融合⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯584．5阳性克隆的筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯604．6腹水的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯604．7单克隆抗体的纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯604．8蛋白与胶体金结合最佳pH⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯614．9NC膜的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯614．10胶体金颗粒大小的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯614．11试纸条的假阳性问题⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯625结论·⋯···⋯··⋯⋯⋯⋯⋯⋯··⋯····⋯”“”⋯⋯⋯”一⋯”““”””””·636参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯647致{射⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯”⋯⋯⋯⋯⋯“⋯⋯⋯⋯⋯⋯”73IV符号说明山东农业大学硕士学位论文中文摘要鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒(DHV,duckhepatitisvirus)引起的主要发生于3周龄以下雏鸭的一种传播迅速、致死率高的传染病(Woolcock,P．R．eta1．2003)。本课题对DHV

4、-I病毒结构蛋白VPl进行了原核表达，制备了抗DHV-I的单克隆抗体，研制了检测DHV-I的胶体金试纸条。通过RT-PCR方法扩增DITV-IVPl基因片段，并定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)中，得到的重组质粒转化进大肠杆菌Rosetta(DE3)PLys中，利用IPTG诱导表达得到大小为47KD的融合蛋白；Westernblot分析发现该重组蛋白能与抗DHV-I阳性血清进行反应，具有良好的免疫学活性。用纯化的DHV-I病毒作为抗原免疫BALB／C小鼠并建立了间接ELISA筛选方法。经反复试验确定了间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株

5、的最佳反应条件，即纯化的抗原以1：800稀释，4℃包被过夜，以1：4000稀释阴、阳性血清分别作为阴阳性对照，反应条件以37℃90min为最佳，酶标二抗的工作浓度为l：1000稀释。取免疫小鼠脾脏与骨髓瘤细胞进行融合，以建立的间接ELISA筛选方法对融合的杂交瘤细胞进行检测筛选，经过初检、二检、三检共获得阳性杂交瘤细胞株21株，利用有限稀释法进行了3．4次亚克隆(其中最少有两次为单克隆)后获得5株能稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株，分别命名为1E10、4F8、4E6、5G4、5Ell。对这5株杂交瘤细胞株的稳定性、染色体数、亚类、腹水效价、特异

6、性进行了鉴定，结果如下：经连续传代20次和冻存后4个月复苏检测，其分泌抗体的能力差异不显著，稳定性好；染色体数介于100～110之间，具有典型的杂交瘤细胞染色体特征；经亚类鉴定，1E10、4F8、4E6、5G4、5Ell杂交瘤分泌的抗体类型分别为IgG2b、IgM、IgGl、IgM、IgGl；单抗腹DI-IV-I单克隆抗体的制备与胶体金试纸条的研制水效价分别为1：400，1：8000，1：8000，l：32000，1：16000；并具有很好的特异性。通过硫酸铵沉淀法对腹水单克隆抗体进行纯化并测定了其蛋白含量；在确定标记单克隆抗体最低稳定量后，

7、成功制备了金标单克隆抗体；经反复摸索确定了NC膜最佳包被单克隆抗体的量为lmg／mL，羊抗鼠最佳包被浓度为1：10稀释，同时两者按照1IXL／cm喷膜；选择Ahlstrom8964和GRADE7589分别作为金标垫和样品垫制备胶体金试纸条。分别用样品稀释液和病毒液作为阴阳性对照检测试纸条，结果阴性对照只出现质控线而病毒稀释液出现检测线和质控线。临床检测结果表明该胶体金试纸条特异、敏感，可用于DHV-I的快速诊断。关键词：DHV、原核表达、单克隆抗体、胶体金、免疫层析试纸条2山东农业大学硕士学位论文AbstractDuckhepatitisis

8、akindofhighlycontagiousandlethalinfectiousdiseasewhichcausedbyduckhepatitisvirus．D