奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌fnbpa高免血清的制备和核酸疫苗的研究

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1、分类号：S855.1+1学校代码：10758密级：公开学号：09020271硕士学位论文奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌FnbpA高免血清的制备和核酸疫苗的研究PreparationofFnbpAImmuneAntibodyandStudyonDNAVaccineforBovineMastitisCausedbyStaphylococcusaureus研究生姓名王世民导师姓名及职称冉多良教授合作导师姓名及职称苏艳副教授学位门类级别农学硕士专业名称预防兽医学研究方向微生物基因工程所在学院动物医学学院新疆·乌鲁木齐二○一二年六月独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师

2、指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得新疆农业大学或其他教育单位的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年月日关于学位论文使用授权的说明本人完全了解新疆农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：新疆农业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，允许论文被查阅和借阅。本人授权新疆农业大学将学位论文的全

3、部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以公布（包括刊登）论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌FnbpA高免血清的制备和核酸疫苗的研究摘要奶牛乳腺炎（cowmastitis）是制约奶牛业发展和危害消费者健康的重要因素之一。国内外相关资料显示，近年来各种类型的乳腺炎特别是隐性乳腺炎的发病数约占泌乳期奶牛总数1/3，而且发病率呈不断上升趋势。奶牛乳腺炎主要由大肠杆菌和金黄色葡萄球菌引起，其中以金黄色葡萄球菌的危害较大。由于奶牛养殖业中抗生素长期和盲目的使用及金黄色葡萄球菌本

4、身很容易产生抗药性的特点，其防治难度越来越大。金黄色葡萄球菌感染动物，会吸附和定殖组织器官的细胞上。纤连蛋白结合蛋白A（fibronectinbindingproteinA，FnbpA）和凝集素因子A（clumpingfactorA，ClfA）在金黄色葡萄球菌定殖过程中起到关键作用，其中FnbpA对组织中的纤连蛋白（fibronectin，Fn），纤维蛋白（fibrinogen，Fg）以及胶原纤维（elastin，En）等都具有吸附并结合的功能。本研究的目的就是着手于金黄色葡萄球菌对动物的感染途径中，阻止细菌对细胞间质和细胞的吸附作用，从而达到预防细菌感染的目

5、的。本研究根据GenBank中发表的基因FnbpA序列保守区设计引物，以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模版利用PCR技术扩增FnbpA部分基因，连接到pMD-18TSimple载体并进行序列测定。结果表明，获得的FnbpA基因片段同国内国际发表的基因同源性在77%-98%。同时，以FnbpA的A区设计引物，进行PCR扩增，扩增产物和PGEX-4T-2空载分别双酶切，构建原核表达载体pGEX-Fn，转化至BL21大肠杆菌中进行诱导表达，表达产物经GST凝胶纯化，经SDS-PAGE电泳检测，结果在66kD附近出现了清晰的目的蛋白条带，与预期的分子量大小相一致，将纯化

6、的蛋白经弗氏佐剂乳化对家兔进行皮下注射免疫，制备高免血清，用间接ELISA方法检测抗体效价，三免后血清检测效6.18价可达10。以pVAX-1为真核表达载体，用延伸PCR方法在目的基因的5'端加入荷斯坦奶牛IFN-γ基因的信号肽序列构建PV-SFn质粒。构建成功的质粒序列经生物信息学软件分析和WesternBlot试验证实，表达产物具有典型的信号肽序列且能够成功的在BHK-21细胞中分泌表达，抗原性没有发生变化。I将去内毒素的重组质粒100μg/只以壳聚糖为佐剂肌肉注射免疫体重25g左右健康C57小鼠，3周后进行第二次免疫。同时设PBS和pVAX-1质粒对照组

7、。在每次免疫后一周采血进行ELISA抗体检测。二免后3个月采取小鼠脾脏淋巴细胞进行MTT试验，检测淋巴细胞增殖情况。同时对其他小鼠进行攻毒试验，计算保护率。ELISA结果显示实验组小鼠一免后抗体效价稍有提高，二免后抗体效价进一步得到提高；MTT试验结果显示，实验组小鼠淋巴细胞的SI值比对照组要高，说明该核酸疫苗一定程度上激活了小鼠细胞免疫系统；攻毒试验结果为对照组保护率为0，实验组保护率为60%。本研究为新疆奶牛乳腺炎流行病学调查和防治以及核酸疫苗的应用奠定了基础，为奶牛乳腺炎的治疗提供一种新的途径。关键词：奶牛乳腺炎；FnbpA；DNA疫苗；信号肽；壳聚糖I

8、IPreparationofFnbpA