腹腔镜co2气腹对异位子宫内膜细胞凋亡的影响及其分子机制

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1、浙江大学博士学位论文腹腔镜CO2气腹对异位子宫内膜细胞凋亡的影响及其分子机制姓名：陈利青申请学位级别：博士专业：妇产科学指导教师：林俊201202浙江大学博二{：学位论文中文摘要腹腔镜c02气腹对异位子宫内膜细胞凋亡的影响及其分子机制浙江大学医学院2008级博士研究生导师妇产科学陈利青林俊教授中文摘要子宫内膜异位症(Endometriosis，EMs)指具有生长功能的子宫内膜组织(腺体和问质)出现在子宫腔被覆内膜及宫体肌层以外的其他部位。是一种常见的妇科疾病，在育龄期妇女中的发病率高达lO％．15％，子宫内膜异位症所引起的不孕、痛经、慢性盆腔痛等症状严重影响了患者的身心健康和生活质量．手术

2、或者手术联合药物治疗是EMs目前最主要的治疗手段。但术后复发已经成为治疗子宫内膜异位症一个非常棘手的问题，术后5年累积复发率高达40％．50％，其复发率高，复发时间短等已经严重影响了患者的生活质量。因此减少复发对提高EMs治愈率具有重大的临床意义。腹腔镜手术有着创伤小、术后疼痛轻微、住院时间短，恢复快以及独特的美容效果等优点．相比开腹手术，能早期发现和更彻底的清除异位子宫内膜微小病灶，是EMs诊断的金标准及治疗的首选方式，并且已在妇产科领域广泛应用。虽然腹腔镜手术在治疗EMs细微病灶和彻底性方面比进腹手术有更显著的优势，但其复发率却无明显下降．众所周知，和开腹手术不同的是，腹腔镜手术需要持

3、续灌注二氧化碳(C02)以保持人工气腹．其无色、非炎性、不可燃，且能通过呼吸道迅速排出体外，同时相比其它可用于气腹的气体，C02易溶于水，减少了气体栓塞这种腹腔镜术中最严重并发症的发生，迄今被认为是气腹的理想气体．已知C02¨I浙江大学博士学位论文中文摘要具有活跃的生理功能并对机体产生病理生理效应，尤其是改变腹腔内环境而影响腹腔内病变。这迫使我们深思，腹腔镜手术方式本身尤其是人工气腹介质C02气体本身是否会影响残留异位内膜细胞的生长，从而参与了EMs的复发?迄今为止尚未发现有关C02气体与EMs及异位内膜细胞生长关系的报道。近年发现，C02气体与肿瘤环境、局部免疫及肿瘤细胞的生长、种植与转

4、移等关系密切。C02可通过引起腹腔镜局部酸中毒、低温、组织干燥及机械压力升高等促进腹腔内肿瘤如卵巢癌、结肠癌、肝癌等腹腔内残留肿瘤细胞播散及穿刺部位种植，其严重程度与C02气体人工气腹的灌注压力和时间呈正相关。此外，C02气体尚可通过改变肿瘤患者腹腔局部微环境，如诱导肿瘤转移相关的粘附分子、血管生长因子、基质金属蛋白酶等表达，抑制腹腔免疫细胞的数量和活性，改变腹腔内多种细胞因子表达水平等促进肿瘤细胞的种植生长和侵袭。在众多关于C02气体的研究中，其对肿瘤细胞生长的影响尤为引人注目。有研究表明，C02气体本身具有刺激某些肿瘤细胞存活和生长的效应，在经过C02气体处理后，细胞活性明显增强，且细

5、胞凋亡减少。但目前C02气体促进肿瘤生长的确切机制还不清楚。EMs尽管是一种良性病变，但异位的子宫内膜病灶却表现出异常的种植、侵袭、甚至转移、复发等类似恶性肿瘤的生物学表型。异位子宫内膜细胞本身还具有异常的凋亡特征。基于对EMs的病因、发病机制、复发及腹腔镜手术微环境的深入分析，设计了本课题。首先建立异位子宫内膜细胞原代培养的方法，设计简单、便携的腹腔镜气腹模拟装置建立人工气腹，给予不同压力的C02气体处理不同的时间后，选择三个时间点来检测C02气腹对异位子宫内膜细胞生长、凋亡的影响。筛选影响最强的压力、时间点和处理时间；利用蛋白芯片技术筛查显著影响的蛋白，并进一步进行验证。为将来改进EM

6、s手术方式以及减少术后复发提供新的思路．Ⅳ浙江大学博一i?学位论文中文摘要第一部分腹腔镜C02气腹对异位子官内膜细胞生长和凋亡的影响目的：探讨腹腔镜C02气腹对原代培养的异位子官内膜细胞体外增殖和凋亡能力的影响。方法：原代培养异位子宫内膜细胞；建立腹腔镜C02气腹体外模型；在细胞处于对数生长期时，以不同压力(5mmHg、10mmHg、15mmHg)的C02气腹对传代的异位子宫内膜细胞分别处理不同时间(1h、2h)，设未处理组为对照．分别于处理后的24h，48h，72h进行细胞形态的鉴定(倒置相差显微镜、透射电镜)、采用流式细胞仪检测各组细胞周期分布；采用山mexin．V．FITC双染法测凋

7、亡比例；运用TUNEL法检测各组的晚期凋亡。结果：1．原代培养的异位子宫内膜细胞在倒置显微镜镜下观察可见间质细胞呈梭行，平行状排列。腺上皮稀少，呈团状、漩涡状排列，细胞呈多角形或蝌蚪形。其形态同在位内膜间质细胞和腺上皮细胞相似。传代后，99％的细胞均为问质细胞。2．二氧化碳气腹组与对照组比较，pH值显著下降(p<0．05)；高压力组和低压组之间比较，高压力组pH值下降幅度又大于低压力组；压力越大，pH值下降越大，其中15