多种乙型肝炎病毒突变株可调控性表达细胞系的构建

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1、'I、l：、11．L目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5研究论文引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯10第一部分前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯13目U百⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯．13材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯14结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．18附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯20讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯26小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯27参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯27第二部分前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯29日U吞⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯29材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯29结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯33讨{仑⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯36小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯37参考

3、文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯37综j苤⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯40致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯52中文摘要多种乙型肝炎病毒突变株可调控性表达细胞系的构建摘要乙型肝炎病毒(船V)持续感染是一世界性的卫生问题，慢性肝炎终至肝硬化甚至肝细胞癌的发生。随着疫苗的普遍接种及抗病毒药物的广泛应用，有效的降低了发病率及死亡率，但是也给人类带来一系列的问题：疫苗／诊断逃逸突变以及核苷类似物长期应用引发耐药导致检测和治疗的失败。这些

4、突变株与野生株相比，在生物学特性方面必然有其特殊性。为了进一步了解突变株对病毒复制力、疫苗接种效能所带来的影响，以及研究核苷类似物的耐药机制、筛选新型药物，有必要建立全基因组的细胞模型。国内外研究表明，HepG2和Huh7细胞瞬时转染乙肝病毒质粒后，能够支持乙肝病毒的复制。然而，由于缺乏复制的稳定性，对药物筛选等高要求的实验是不适用的。HepG2．2．15细胞系是目前公认的应用最广泛的乙型肝炎细胞模型，并且被广泛应用于抗病毒研究。不仅病毒复制均衡、变异小，而且经多代培养仍可以长时间地维持病毒复制。但是病毒复制水平较低，并且不能人为控制。为解决目前面临

5、的难题，有必要构建一个稳定的、可诱导表达的HBV突变株细胞系。四环素(Tet)诱导的基因表达系统是目前研究和应用最为广泛的真核细胞基因表达系统。本研究就是利用PCR、酶切等手段构建多个HBV全基因组突变株，转染前期已构建成功的tTA细胞系，用潮霉素筛选，构建多个突变株可调控性表达细胞系，并作为细胞模型检测已知的HBV抑制剂的作用。为进一步完善HBsAg诊断试剂盒及其变异监测、研究耐药机制、筛选新型抗病毒药物奠定了实验基础。本研究共分2部分完成。第一部分多种HBV突变株可调控性表达细胞系的构建目的：应用分子生物学技术，将HBV突变株克隆到pTRE2Hy

6、g载体上，构建8个HBV全基因组突变株。通过转染前期实验构建成功的tTA细胞系，构建多种突变株可调控性表达细胞系，观察病毒表达情况，证明稳定复制能力及可调控性。方法：1应用PCR和酶切重组技术，在PCH．3093质粒P基因RT区B，C，D中文摘要亚功能域173，180，181，204，236位点及S基因区100，120，145位点实现定点突变，并克隆到pTRE2Hyg载体上，构建具有潮霉素抗性的pTRE-HBV-A181T'pTRE．HBV-N236T,pTRE．HBV-A181T-N236T,pTRE-HBV-M204I，pTRE—HBV-L180

7、M．M204V,pTRE．HBV-V173L．L180M-M204V,pTRE—HBV-G145R，pTRE．HBV-Y100C．P120T8个质粒。2通过酶切及测序鉴定新构建质粒的正确性后，大量提取质粒。3前期实验已经成功构建了整合有ptTA2质粒的HepG2细胞系(G2TA2—7)。上述8个新构建质粒和pTRE．WMHBV分别转染此细胞，经潮霉素筛选，获得阳性细胞克隆。4分别经过PCR筛选出高分泌突变HBVDNA及WMHBVDNA颗粒的细胞系。5在无抗生素筛选条件下，连续传代20代，Southernblot观察其稳定复制能力，并挑选最佳细胞系。6

8、细胞系可调控性的鉴定应用southernblot验证各细胞系在强力霉素去除或加入时HBVDNA的表达情况。7