家蚕尿苷二磷酸-葡萄糖基转移酶基因bmugt4965的克隆和真核表达

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1、西南大学硕士学位论文●譬商尔纂腔箦图1．1糖基转移酶域结构简图【4I】Fi91．1Domainstructurediagramofglycosyltransferase超家族最大的一个特征是其包含一个高度保守的“DXD”基序，它的作用是将糖基与另外的糖基、磷酸盐和蛋白结合，对酶的催化活性起不可或缺的作用。二价阳离子(通常是Mn2+)通过其配位作用使“DXD”基序与NDP．糖供体的磷酸基相连，稳定磷酸基负电荷并能使核苷酸与糖之间的化学键变得脆弱易断。GT-B家族中的蛋白两个Q邝／Q结构域彼此相对且自由连接，其C．末端结构域是一典型的核苷酸结合结构域，与NPD．糖供体结合。与GT-A超家

2、族不同的是，它没有“DXD”基序，催化反应也需要金属离子参与，Q邝／Q折叠结构起着关键作用，其螺旋偶极效应可起到稳定供体中磷酸基负电荷的作用，两个Q／且／Q螺旋也分别与供体中的对应基团结合【7】。糖基化反应的进程，对于反向型糖基转移酶，比较简单，经过一个氧络正碳离子．离子样的过渡状态，酶催化激活路易斯酸，使之脱去一份磷酸盐，受体对供体的cl进行亲核攻击完成一个简单的类似SN2亲核取代反应。保留型糖基转移酶则较为复杂，人们一般认为其反应符合breton等提出的双置换机制18】，即经过两步氧络正碳离子转换过程和一个糖基．酶中间复合体。然而一直未能找到相应的糖基．酶中间复合物，而且对于糖基

3、转移酶是否有亲核攻击性也有争议，因此其反应机制目前仍属推测，有待于进一步研究。1．2尿苷二磷酸(UDP)糖基转移酶的研究进展1．2．1哺乳动物中的尿苷二磷酸．葡糖醛酸转移酶解毒和排除内源和外源化合物是所有生物的的重要生命过程，有几种酶都参与其中，包括细胞色素P450超家族、短链脱氢酶家族、谷胱甘肽．S．转移酶家族和UDP．糖基转移酶(UGTs)家族的成员[9-12J。UGTs是一个超家族的酶，催化糖基从核苷酸糖如UDP．葡萄糖醛酸、UDP．半乳糖、UDP一葡萄糖或UDP．木糖转移到各种疏水小分子(苷元)，形成亲水化合物，改变了其生物活性、溶解性和在组织细胞间的转运特性以利于排除等Il

4、31。到目前为止，研究的最多和最清楚的是哺乳动物的糖基转移酶。哺乳动物中的糖基转移酶为UDP．葡糖醛酸转移酶(UDP．glucuronosyltransferases，EC2．4．1．17)，主要以UDP．葡糖醛酸(UDP．glucuronicacid)作为糖供体，这类酶主要存在于鱼类和哺乳动物中。哺乳动物UGTs识别差异十分巨大的底物并催化许多功能基团(如．OH，-COOH，-NH2，．SH，和C．C)的葡糖苷酸化【l41。由于它们在代谢和解除许多外源化合物比如致癌物质和疏水性药物的毒性方面起重要2第一章文献综述Ill一一一．III—II曼曼曼曼皇舅曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼皇曼曼曼

5、!勇曼曼曼鼍曼曼曼作用，在过去的几十年其在制约和临床研究上的潜在价值引起了人们的J～泛关注而得到了深入的研究【”】。这个多酶系统与细胞色素P450酶有许多相似之处，催化许多广泛的具有不同化学结构和理化性质的内源和外源化合物的糖基化，这些反应增加了疏水底物的极性，多数情况下糖基化使这些底物失去活性。糖基化在生物体内行使广泛的功能，对有些化合物(如维生素A类)的生物活性甚至是毒性的产生起决定性作用，特别是吗啡、类固醇、胆汁酸和类视黄醇有些情况下经过生物转化变得更具毒性；激活生物活性物质，如多环芳香族碳氢化合物和杂环芳香族胺类；使某些生物活性物质失去活性【141。1．2．1．1哺乳动物尿苷

6、二磷酸．葡糖醛酸转移酶的命名、分类及其性质为了命名每个基因，对于人用字根符号UGT(老鼠和果蝇为Ugt)表示UDP．糖基转移酶(“UDP．glycosyltransferase”)，随后一个阿拉伯数字表示基因所属的家族，一个字母代表亚家族，接着一个阿拉伯数字代表该家族或亚家族中的单个基因(老鼠相应的阿拉伯数字前加连字符)，例如人UGT281和鼠Ugt2b．，。基因和cDNA应该斜体书写，相应的转录物，蛋白质和酶活性产物不用小写字母或斜体书写Il引。哺乳动物UGTS超基因家族目前已有“7个成员，包括四个亚家族，UGTl，UG他，UGT3和UGT8

7、12】。UGTl和UGT2家族的酶以U

8、DP．葡萄糖醛酸作为糖供体的催化效率最高，这些酶也能利用其它UDP．糖包括UDP．葡萄糖和UDP．木糖作为糖供体【17．埽】。UGT3家族的酶对UDP．糖的催化特异性还不清楚，而UGT8A1以uDP．半乳糖作为糖供体【19】。大多数的UGTs(比如UGTl、UGT2)在对外源和内源物质的解毒过程中起着极为重要的作用。因为糖基化的化合物水溶性增加，增强了其进入体内细胞内外含水部分的能力，便于其运输进入排泄器官，随后通过胆汁和尿排出。此外它们也参与了许多其它的