家蚕N-酰胺基葡萄糖基转移酶cDNA的克隆与表达特征分析.pdf

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1、IIIIII摘要葡萄糖基转移酶(GlcNAcases)是一组主要催化N-糖链生成的酶类,主要分布在生物细胞中的高尔基体和内质网上。能够对各类糖类以及非糖类等大分子进行修饰加工，从而实现其各类分子的生物学功能。昆虫的GlcNAcases在多种生理生化过程中都起非常重要的作用，包括对外源性和内源性细胞底物进行合成、分解、加工和修饰等许多方面。本研究对家蚕的GlcNAcases的cDNA进行了克隆、原核表达以及组织表达等分析。主要研究结果如下：1、根据家蚕基因组及相关数据库的GlcNAcases序列信息，设计特异性引物，克隆获得了

2、目的基因。序列分析表明该基因ORF包含1113个碱基，编码370个氨基酸，具有GlcNAcase催化功能的结构域包含45个氨基酸序列，属于糖基转移酶基因家族。构建该基因系统进化树，结果表明，所克隆的家蚕的目的基因序列与鞘翅目昆虫GlcNAcases同源性最高，命名为BmGlcNAcaseA。2、将目的基因产物连接到质粒pET-28A（+）表达载体上，并构建重组质粒pET-28A-BmGlcNAcaseA，转化感受态细胞DE3。优化表达条件诱导其在大肠杆菌中进行原核表达。经过SDS-PAGE和WesternBlot分析，结果表

3、明，目的蛋白得到成功表达。利用NI-NTA亲和层析柱对获得的重组蛋白进行蛋白纯化并制备多克隆抗体，获得的抗体效价为11400。3、经RT-PCR和WesternBlot检测表明BmGlcNAcaseA在家蚕组织水平的表达存在差异。BmGlcNAcaseA在卵巢和表皮表达量最高，其次是在中肠和脂肪体，血液、精巢和马氏管表达最少。BmGlcNAcaseA家蚕表皮生长期间表达量显著上升，家蚕BmGlcNAcaseA基因可能与家蚕的表皮生长有关。4、家蚕5龄幼虫经核型多角体病毒、藤黄微球菌、白僵菌以及大肠杆菌的处理后，BmGlcNA

4、caseA基因表达量总体呈现先下降后上升的规律。BmGlcNAcaseA对病毒的反应较敏感，而对其他三种菌的应答比较慢。经核型多角体病毒刺激处理后的BmGlcNAcaseA基因表达量在6h左右达到最高，其它三种菌则是在9h左右达到峰值，并都在12h左右降到最低，以上结果预示着BmGlcNAcaseA可能参与了外原微生物引起的家蚕免疫应答过程。综上所述，BmGlcNAcaseA在不同组织中的表达水平存在差异性，这与其在组织中的功能密切相关。本文对BmGlcNAcaseA的克隆表达为下一步研究其在家蚕以及昆虫中功能作用奠定基础。

5、关键词：家蚕，葡萄糖基转移酶，cDNA克隆，蛋白表达，功能分析IVAbstractGlucosetransferase(GlcNAcase)isagroupenzymescancatalyzeN-alkylationofsugarchaingeneration,whichwasmainlydistributedintheGolgiapparatusandEndoplasmicreticulumofbiologicalcell.Varioustypesofcarbohydrateandothernon-carbohydrate

6、compoundscanbemodifiedandthebiologicalfunctionofvariousmoleculescanbeachievedbyGlcNAcases.GlcNAcasesofinsectsplayaveryimportantroleinavarietyofphysiologicalandbiochemicalprocesses，includingexogenousandendogenouscellularsubstratessynthesis,decomposition，processing，m

7、odificationandotheraspects.ThegenecDNAwhichencodedGlcNAcaseinsilkwormwasclonedandexpressedinthisresearch.Themainresultsareasfollows:1.ThespecificprimersweredesignedbasedontheinformationfromtheGenBankandotherrelatedinformationoftheknownsequencestoclonetheGlcNAcasecD

8、NA.TheGlcNAcasecDNAsequencewas1113bp，whichencoded370aminoacidpeptideincludingacatalyticsequencecontains45aminoacidsdomain.Phylogenetictreesuggest