杨树盐逆境响应基因ptraba2f的功能研究

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1、，．··一～‘~、躲、，一1”41毪，弋、孝；l知夕、、_．_-一一7Z秀庐夕擎硕士研究生学位论文杨树盐逆境响应基因PtRabA2f的功能研究申请人：学号：培养单位：学科专业：研究方向：指导教师：完成日期：代丽红2111236生命科学学院生物化学与分子生物学植物生物技术与基因工程鲁振强副教授2014年3月25日

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7、号C．级类D分U密中文摘要d,G1’P结合蛋白在真核细胞中参与信号转导、细胞增殖、细胞骨架重组和细胞内的膜运输等多种过程。这些蛋白质的功能作为分子开关周期性调节激活和失活状态，该循环被链

8、接至UGTP结合和水解之间。在木本植物中，对毛果杨中的小G蛋白家族进行测序有114个成员，分4个亚家族，其中Rab达66个占成员总量的57％。另外，毛果杨d'G蛋白家族成员比拟南芥多21个，这种差异可能是在暗示杨树中的小G蛋白家族在功能上的特异性。本试验是对杨树PtRabA2_，基因功能的深入研究。通过RT-PCR方法从毛果杨cDNA中扩增得到尸坎口鲥狴因，ORF片段大小为65lbp。在构建植物表达载体的时候，本实验选择了使用GateWay技术。先将目的基因RabA2f与pENTR．SD．D．TOPOd?间载体

9、连接，得到中间载体pENTR．RabA2f；再通过置换的方式将RabA2f连接到质粒pGWB2I-形成pGWB2．RabA2f,利用农杆菌介导法分别转到毛果杨、拟南芥中，通过筛选鉴定获得PtRabA2勰表达体系毛果杨、拟南芥。通过对LLWT、pGWB2币nT2．PtRabA2f-5拟南芥生长状况，在正常平板中T2．P一5组拟南芥长势明显较好，显示出鲜重重、植株高、叶片鲜亮且较大、根长长等特点，在逆境胁迫下其长势、根长和鲜重均优于pGWB2组和WT组，受胁迫影响小。检测毛果杨RabA2f基因表达特性，以Actin

10、l基因作为内标基因。使用半定量PCR方法。分别在200mmolFLNaCI、8％PEG、200mmolfL甘露醇、干旱、10mmol／LH202胁迫下，与对照相比PtRabA2f基因的表达水平呈现明显的上升状态且每一时间段都高于WT组和pB2组，在24h表达量最高。NaC!胁迫处理24h时，To．PtRabA2f-3型杨树表达量为WT型的3．54倍；甘露醇胁迫处理24h时，To．P．3型杨树表达量为WT型的1．36倍；H202胁迫处理24h时，To．P．3型杨树表达量为WT型的2．77倍；PEG胁迫处理24h时

11、，To．P．3型杨树表达量为WT型的2．37倍；干旱胁迫处理24h时，To．P．3型杨树表达量为WT型的2．5倍。对w，r、pB2和T2．PtRabA2f-5组拟南芥各反应时问测其GTP水解能力变化，黑龙江大学硕士学位论文结果显示当处于90min时GTP水解能力最大。分别在80mmol／LNaCI、8％PEG、200mmol／L甘露醇、10mmol／LH202胁迫处理0h、2h、12h、24h时测其GTP水解能力变化。结果显示T2．PtRabA2f-5超表达体系拟南芥比野生型拟南芥水解程度高。在80mmol／L

12、NaCI下：T2．PtRabA2f-5组拟南芥叶绿素含量在24h到144h时呈下降趋势，并在144h时达到最低值，T2．P一5在144h比对照提升了15．35％、在168h比对照提升了17．34％，差异显著。在8％PEG下：T2一P一5组在144h比对照提升了2531％、在168h比对照提升了26．64％，差异显著。在200mmol／L甘露醇下：T2．P一5组在144h比对照提升了24．43％、在168h比对照提升了25．99％，差异显著。在10mmol／LH202下：T2．P一5在l68h比对照提升了36．3

13、3％，差异显著。以上结果表明，转PtRabA2f基因拟南芥品系在胁迫条件下叶绿素含量更为稳定受胁迫影响较小。在80mmol／LNaCI下：1"2．PtRabA2f-5组拟南芥电导率比WT和pB组电导率值小，变化缓慢随着时间延长这种趋势更明显，T2．P．5组的电导率含量在24h比对照降低了6．01％、在168h比对照降低了29．81％，差异显著。在8％PEG下：T2．P一5在24h比对照降低了6．25％、在168h比对照降低了27．54％，差异显著。在200mmol／L甘露醇下：T2．P一5在24h比对照降低了6

14、．34％、在168h比对照降低25．21％，差异显著。在10mmoi／LH202下：T2．P一5组在48h比对照降低了4．62％、在168h比对照降低了28．67％，差异显著。以上结果表明，转PtRabA2f基因拟南芥品系在胁迫条件下电导率含量更为稳定受胁迫影响较小。关键词：杨树；RabA2f超表达；逆境胁迫AbstractSmallGTP—bindingproteintakepart