杨树phigst基因家族功能分化研究

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1、杨树phiGST基因家族功能分化研究1引言1.1GSTs家族的分类与命名植物GSTs是一个庞大的多基因家族，其成员众多，因此建立一个科学的分类系统对研究该基因家族的功能非常重要。目前的分类系统最早由Droog于1997年提出(Droog,1997),然后在2000年Edbda和DHAR(Dixoal.，2002a)。2005年，四氯氛醌脱齒素酶(TCHQD)、真核翻译延伸因子1B的Y-亚基(EF1By)也加入到GST超家族(Oakley,2005)。因此目前植物GST基因家族分为tau、phi、theta、zeta、DHAR、lambda、TCHQD和EFl

2、By八个类型(Smithetal.,2004)，其中tau、phi、DHAR和lambda四类为植物特有的GST类型，而tau和phi类GST在植物中通常具有较多的成员数目。在2000年之前，GSTs命名系统比较混乱，为了最大限度地减少歧义，Edbda-L等（见图丨-1)，n是在亚家族中同功酶的数量。因此代表拟南芥中第19个被命名的tau类GSTs基因。编号通常是基于发现的顺然而由于基因组测1+的完成，可以根据其染色微粒体的(Edbda和TCHQD。尽管微粒体类GST与主要的GST超家族没有关联，但它可催化依赖GSH的反应。作为二相解毒酶，GSTs广泛参与了

3、植物的解毒、抗逆、抗氧化、信号转导和作为配体或者分子伴侣参与植物体的生长发育过程。植物GSTs的基因结构己经研究的很清楚，而且已知的许多GSTs基因的染色体定位也已经完成(Edpranisetal.,2000)等。2毛白杨phi类GSTs分子克隆与结构分析2.1材料与方法2.1.1实验材料实验材料毛白杨（PopuluntomentosaCarr.)取自自然生长条件下，树龄三十年左右，地点中国科学院北京植物园，时间2012年4月2.1.2毛白杨cDNA的合成1)将毛白杨叶片组织100mg剪碎研磨充分，加入到2ml无RNase的离心管，按照TIANGEN多糖多酹

4、植物总RNA提取试剂盒的操作流程，加入1ml裂解液SL(预先已经加入P-琉基乙醇)，立即润旋泡勾。2)将上一步得到的样品65t：水浴30min，以确保其中的核蛋白体完全降解。4V12000rpm离心2min,将上清液转移到置于收集管中的过滤柱CS中，12,000rpm离心2min。3)将离心后得到的上清转移到新的RNase-Free的离心管中，操作中尽量保证枪头不要吸入收集管底部的细胞碎片沉淀。加入0.4倍上清体积的无水乙醇并混匆，若有沉淀出现属于正常现象，则将得到的溶液和沉淀全部转入到吸附柱CR3中，12,000rpm离心15sec，弃掉收集管中的废液。4

5、)将吸附柱CR3放回收集管中，并向其中加入350ml去蛋白液R离心15sec，将收集管中的废液倒掉，再将吸附柱CR3放回收集管中。5)配制DNaseI工作液用于样品中DNA的处理：在新的RNase-Free离心管中分别加入10mlDNaseI储存液和70RDD溶液，吹打混勾。然后悬空向吸附柱CR3中央加入80nl的DNaseI工作液，室温放置15min。3毛白杨phi类GSTs基因表达模式分析........283.1材料与方法.......283.2结果与分析.......293.2.1毛白杨总RNA的提取.......293.2.2毛白杨cDNA的检测.

6、......303.2.3RT-PCR结果检测.......303.3讨论.......314毛白杨phi类GSTs蛋白质的功能研究.......324.1实验方法.......324.2结果与分析.......374.3讨论.......425结论.......444毛白杨phi类GSTs蛋白质的功能研究4.1实验方法利用DNAclub及PrimerPremiers.0软件，根据以上实验得到的cDNA序列，设计表达引物PtoGSTF4-EXl/EX2、PtoGSTF5-EXl/EX2和PtoGSTF7-EXl/EX2(见表4.1)。引物设计主要遵循以下三点

7、原则：（1)需要在上下游引物引入限制性酶切位点，以便于将三个基因定向插入到表达载体上；（2)需要酶切位点的序列是不存在于基因序列内部的；（3)酶切位点需要位于PET30a表达载体上两个组氨酸标签之间，并且两者不能不相邻。本实验使用全式金生物技术有限公司的PEASY-T3CloningVector试剂盒，将纯化得到的PCR产物连接入PEASY-T3载体，进行快速克隆。将连接产物转入Transl-Tl感受态细胞中，均勾涂布于LB固体平板倒置培养过夜。利用蓝白斑蹄选的原理挑取白色单菌落进行菌落PCR检测，选择阳性克隆接种于LB液体培养基中(含有0.05mg/mlA

8、nip+)进行培养，并进行双向测序。具体操作步骤见2