cflip在宫颈癌发病机制中意义及shrna靶向逆转的研究

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1、华中科技大学硕士学位论文cFLIP在宫颈癌发病机制中的意义及shRNA靶向逆转研究摘要凋亡不仅与胚胎发育、机体内环境动态平衡及免疫应答密切相关，也为肿瘤的研究开辟了新方向。肿瘤不仅仅是细胞无控性生长的结果，其与细胞凋亡异常或凋亡阻抑有着重要关系。细胞凋亡根据其起始转导因子不同分为外源性凋亡途径（死亡受体途径）和内源性凋亡途径（线粒体途径）。其中，外源性凋亡途径的起始转导因子为caspase-8（即FLICE，FADD-likeinterleukin-1-betaconvertingenzyme）。cFLIP（cellularFLICE-likeinhibitoryp

2、rotein）为caspase-8抑制蛋白，1997年由Irmler等在研究恶性黑色素瘤时发现，其结构类似于caspase-8，但不具备酶活性。已有大量研究表明，cFLIP在多种人类肿瘤组织中过表达，在肿瘤的发生发展中起重要的调控作用。封闭cFLIP基因在胃癌、大肠癌、横纹肌肉瘤等肿瘤组织中的表达，能够有效提高细胞的凋亡率及其对化疗药物的敏感性。宫颈癌是严重危及女性健康甚至生命的三大恶性肿瘤之一，近年发病率明显增加，且趋向年轻化。尽管宫颈癌发生的确切分子机制尚不清楚，但研究表明其发生是多种致癌因素长期协同作用的结果，如人乳头瘤病毒（humanpapillomavir

3、us，HPV）持续感染、基因变异和免疫逃避等。关于cFLIP在宫颈癌的发生发展过程中有着何种作用，及其与HPV的相互关系，目前相关报道甚少。RNA干扰（RNAinterference，RNAi）是近年来发现的研究生物体基因表达、调控与功能的一项崭新技术，其本质是由双链RNA诱导的细胞内同源基因的特异性转录后沉默现象，可高效、特异地沉默目的基因，成为目前肿瘤研究和治疗的强有力手段之一。基于上述研究进展，本课题进行如下研究：1华中科技大学硕士学位论文目的：1.检测宫颈病变组织中cFLIP与HPV-16E7的表达、相互关系及临床意义。2.应用shRNA封闭cFLIP基因在

4、宫颈癌细胞中的表达，并解除对caspase-8的抑制作用。3.探索靶向cFLIP基因沉默，降低宫颈癌细胞增殖、提高细胞凋亡率及增强细胞对放疗、化疗药物敏感性的可能性。方法：1.免疫组织化学SP染色法检测40例宫颈癌、40例宫颈上皮内瘤变(cervicalintraepithelialneoplasia,CIN)及20例正常宫颈组织中cFLIP与HPV-16E7的表达情况。2.RT-PCR、WestonBlot分别检测4株宫颈癌细胞Hela、Siha、C33a及Caski中cFLIPS、cFLIPL的mRNA与蛋白表达水平，并选择Hela细胞作后续研究。3.构建靶向c

5、FLIP的shRNA质粒，脂质体2000转染Hela细胞，特异性封闭cFLIP基因表达，RT-PCR、WestonBlot检测基因封闭效果。4.WestonBlot检测下调cFLIP基因对caspase-8蛋白表达的影响；MTT比色法、流式细胞技术分析cFLIP基因表达下调对宫颈癌细胞增殖、凋亡的影响；激光共聚焦显微镜分析凋亡的形态学变化。5.Co60放疗、化疗药物顺铂、伊立替康处理Hela细胞，MTT比色法、流式细胞技术分析下调cFLIP基因对宫颈癌细胞放、化疗敏感性的影响。结果：1.cFLIP及HPV-16E7在正常宫颈组织、CIN与宫颈癌组织中的表达均依次增强

6、(P<0.05)。CINⅠ组与CINⅡ～Ⅲ组及宫颈癌组比较cFLIP表达有显著性差异（P<0.05），宫颈癌组与CINⅡ～Ⅲ级组比较无显著性差异（P>0.05）。cFLIP表达阳性率与宫颈癌病理类型、组织学分级、淋巴结转移及临床分期无关。CINⅡ～Ⅲ组中HPV-16E7(＋)组cFLIP阳性表达率高于HPV-16E7(－)组的表达率(P<0.05)；宫颈癌、CINⅠ组织中HPV-16E7(＋)组和HPV-16E7(－)组cFLIP阳性表达率无显著性差异(P>0.05)。2华中科技大学硕士学位论文2.宫颈癌细胞株Hela、Siha、C33a及Caski均存在cFLIP

7、S、cFLIPLmRNA及蛋白的表达。3.靶向cFLIP的shRNA质粒转染宫颈癌细胞株，可有效封闭cFLIPS、cFLIPL在mRNA与蛋白水平的表达；并影响caspase-8蛋白表达的水平。4.下调cFLIP基因可阻抑Hela细胞增殖并诱导凋亡(P<0.05)；能有效提高Hela细胞对放、化疗的敏感性(P<0.05)。结论：1.cFLIP与HPV-16E7在宫颈癌组织中特异性高表达，cFLIP的特异性高表达是宫颈癌变的一个早期事件，并可能协同HPV-16E7在宫颈癌癌前病变向宫颈癌的发展过程中起重要作用，共同促进肿瘤的发生。2.cFLIP可能成为宫颈癌新的诊