抗cd33单链抗体及免疫毒素scfv-gzb的制备及活性检测

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1、⑧论文作者签名：指导教师签名：燃乒叁峰一论文评阅人1：廑堡塞』数援』逝江盍堂匡堂堕评阅人2：途童红』数授』浙婆太堂医堂瞳评阅人3：虚璺苤丛援』泣逛盍堂医堂睦答辩委员会主席：睦壑壹』数控』浙江太堂药堂院委员。丢盎运』数接￡蓝江态堂荭堂睦委员2：叠丘遗垫撞』敛拯』浙江太堂兰送卫生堂睦委员3：浙江大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝姿盘堂或其他教育机构的学位或证

2、书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解逝姿盘鲎有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝婆叁堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：签字日期金耐筛鸥月。乒日导师签名：签字日期力拦印乡月晔日浙江人学硕士学位论文

3、致谢致谢回顾两年多的学习生涯，我在科研和生活上得到了众多老师、同学和朋友们的热心帮助和大力支持。在此，我要向他们表示我诚挚的谢意!首先，衷心感谢我的导师詹金彪教授。在本论文的选题、设计及最终论文的撰写、润色和定稿的每个环节都得到老师的精心指导；在研究生学习生活的两年多时间里，老师对我授业解惑，关怀备至。导师渊博的知识、敏锐的洞察力、高瞻远瞩的科研思维和严谨的科研作风将是我毕生学习的楷模和追求的目标。借此机会，我向导师表示衷心的感谢和敬意。中科院上海生化与细胞所王克夷研究员及浙江大学药学院陈枢青教授在实验上给予耐心指导

4、，浙江大学医学院黄河教授和王青青教授实验室赠送白血病细胞株，我在此表示衷心感谢。感谢实验室的师姐杨乃娣、范娜娜、赵田田、林莉，实验室同学汤沁、代争、李红蕊、蓝小明以及我的好友张斌、孙婷、艾珠玉等，还有徐立红老师、唐修文老师和王秀君老师实验室的同学。在一起生活和工作学习的美好时光里，感谢你们给予我真诚的鼓励和无私的帮助。最后，我要感谢父母和亲人多年来在生活和精神上给予的无微不至的照顾和支持。让我在漫长的人生旅途中使心灵有了虔敬的归依，为我能够顺利毕业提供了巨大的支持与帮助。本研究受到浙江省重大科技专项：“人源抗体库的建

5、立及其应用”(计划编号：2009C13041)的资助。浙江大学硕士学位论文中文摘要抗CD33单链抗体及免疫毒素scFv．GzB的制备及活性检测浙江大学医学院：生物化学与分子生物学硕士研究生：张珍珍导师：詹金彪中文摘要研究背景：白血病严重威胁人类的健康。据统计，我国白血病的发病率在各种肿瘤中居第六位。目前针对白血病的治疗仍主要采用骨髓移植和化疗等方法，但存在术后复发、毒副反应等问题。免疫疗法成为继化疗和骨髓移植后治疗白血病的新方法，因其毒副作用低、特异性强等优点而得到广泛应用；在常规化疗和移植过程中联合抗体治疗，也取得

6、了良好的效果。近年来随着抗体人源化技术的进步，抗体药物在肿瘤临床治疗领域取得了突破性进展，并逐渐成为全球生物制药领域的热点。研究目的：本实验室以构建好的全人源白血病噬菌体抗体库为基础，成功筛选出与白细胞分化抗原CD33胞外区蛋白特异性结合的单链抗体(seFv)。表达与CD33胞外区蛋白结合性高的scFv并检测其相关活性；构建scFv与人颗粒酶B(GzB)融合的免疫毒素scFv．GzB，并对其进行表达及活性检测；将活性高的单链抗体及免疫毒素成功转入酵母表达体系并大量表达。研究方法：通过ELISA等方法测定单链抗体与CD

7、33胞外区蛋白的结合力，选取结合力较强的序列分别设计相应引物，用体外PCR方法扩增阳性噬菌体抗体基因(1号，23号，76号)，通过引入酶切位点将目的片段重组至表达载体PET30a(+)中，进而转化至EcoliBL21中，表达出单链抗体并检测其活性；同时设计相应引物及Linker将scFv转入实验室已构建并保存的颗粒酶B(PET30a-GzB)重组载体中，表达免疫毒素并测定其生物学活性。研究结果：成功构建三株单链抗体及对应的单链免疫毒素表达载体，并在大肠杆Ⅱ浙江大学硕士学位论文中文摘要菌和甲醇酵母体系中表达、纯化得到活

8、性蛋白。经ELISA及WesternBlot验证，所表达三株scFv与CD33均有较强的结合；经体外细胞毒性测定，l号scFv及l号／76号scFv．GzB均对CD33阳性白血病细胞有杀伤作用。结论：成功表达、纯化三株单链抗体及相应的免疫毒素，并对其活性进行了初步研究，为后期进一步的功能分析打下了基础，为CD33阳性白血病的治疗提供了可能。关键