tcrγδ-ig融合蛋白抗人卵巢癌活性的研究及功能性抗人tcrγδ抗体及单链抗体的制备和鉴定

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1、博士学位论文学校代码：10023学号：B2009250TCRy8．Ig融合蛋白抗人卵巢癌活性的研究及功能性抗人TCRy8抗体及单链抗体的制备和鉴定所院：姓名：导师：导师小组：学科专业：研究方向：完成时间：北京协和医学院基础学院中国医学科学院基础医学研究所郑静何维教授崔莲仙教授免疫学肿瘤免疫2012年5月北京协和医学院博士研究生学位论文目录目录目录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5缩略词

2、表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．9前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。13第一部分TCR丫6-lg融合蛋白抗人卵巢癌活性的研究技术路线⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯16材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．17方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．22结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．29讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．38第二部分功能性抗人TCR丫8

3、抗体及单链抗体的制备和鉴定技术路线⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯43材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．44方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．53结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．63讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．78全文结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．81参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯82文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

4、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯91个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1061改谢．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯⋯．．．⋯⋯⋯．107独创性声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯109北京协和医学院博士研究生学位论文巾文摘要TCRy8一Ig融合蛋白抗人卵巢癌活性的研究及功能性抗人TCRy8抗体及单链抗体的制备和鉴定中文摘要二十余年来，肿瘤的抗体靶向治疗发展迅速。曲妥珠单克隆抗体(Trastuzumab

5、)和利妥昔单克隆抗体(Rituximab)分别被用于靶向性治疗乳腺癌转移和非何杰金式淋巴瘤；并取得了良好的临床治疗效果。肿瘤靶向治疗的关键在于发现肿瘤特异性抗原。然而，已获鉴定的肿瘤特异性抗原数量较少，这大大限制了应用抗体进行肿瘤靶向治疗的发展。除了抗体，肿瘤浸润性T细胞表面的T细胞受体(Tcellreceptor,TCR)也能特异地识别肿瘤抗原，这使之成为肿瘤靶向治疗的理想候选者。据报道，应用TCRot[3进行肿瘤靶向治疗的研究已取得了初步的进展。TCRy982在TCR缺失的JRT3．T3．5细胞中表达，能够赋予后者识别和杀伤肿瘤细胞的能力，表明

6、TCRy982在3,982T细胞对肿瘤细胞的杀伤中起着关键性作用。对肿瘤细胞的特异识别使TCRy982可能像抗体一样应用于肿瘤的靶向治疗。更重要的是，与TCRap相比，TCRy8的抗原识别不受主要组织相容性复合物(Majorhistocompabilitycomplex，MHC)限制，其抗原识别谱可能更广。因此，TCRy6应用于肿瘤靶向治疗可能也具有一定优势。本课题组致力于研究TCRy982在肿瘤靶向治疗中的作用。在前期工作中，本组在人卵巢上皮癌浸润性T淋巴细胞中获得了一个优势TCR82链互补挟定区3(complementarydeterminmg

7、region3，CDR3)序列，将其命名为OT3。实验证明，TCRy982(OT3)是卵巢癌反应性的特异性TCR。用OT3取代抗体重链CDR3区，构建的CDR38(OT3)移植性抗体，保留了其与多种肿瘤细胞的结合特性，但亲和力较弱。为了获得既具有对肿瘤抗原的高亲合特性，又具有抗体生物学功能的融合蛋白，我们将TCRy982(OT31的完整胞外段或可变区分别与人IgGl重链恒定区连接起来，构建了三种TCRT8一Ig融合蛋白，即TCRy982(OT3)一Fc，TCRV82(OT3)一Fc和TCRV82(OT3)H／Vy9LA,。体外结合实验的结果表明，三

8、种融合蛋白中，TCRy982(OT3卜Fc与卵巢癌细胞系和组织的结合能力最强。因此，本研究的第一部分工作，主要研究TTCR