抗ricin中和性单抗4c13单链抗体的真核表达及生物活性检测

《抗ricin中和性单抗4c13单链抗体的真核表达及生物活性检测》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、抗ricin中和性单抗4C13单链抗体的真核表达及生物活性检测【摘要】目的：实现基于中和性单抗4C13单链抗体的真核表达，并对其生物学活性进行评价.方法：用TRIzol提取抗ricin中和性单抗杂交瘤细胞4C13总RNA，扩增其轻、重链可变区基因，登陆GenBank；用Linker（GGGGS）3将VH和VL连接，用重叠延伸PCR克隆入真核表达载体pCDNA3.1，用脂质体转染293T细胞，对瞬时表达产物进行生物学活性检测.结果：中和性单抗杂交瘤细胞4C13轻、重链可变区基因在GenBank中的登录号为DQ38924

2、8和DQ389245，ScFv与ricin可特异性结合，培养上清原液和2倍稀释液的抑制率分别为33.7%和29%；ScFv在ricin浓度为0.01~0.005ng/mL时可中和ricin对SP2/0细胞的细胞毒，随着ricin浓度逐渐增大，细胞存活率逐渐减低.结论：研究结果为研制基于中和性单抗的其他ricin拮抗剂奠定了重要的理论和实践基础.【关键词】ricin；中和性单抗；基因表达；单链抗体　　【Abstract】AIM:Torealizeanantiricinneutralizingmonoclonalant

3、ibodybasedScFvproteinsandtoevaluatetheneutralizingactivitiesofScFv.METHODS:ThetotalRNAanantiricinneutralizingmonoclonalantibodyhybridomacellnamed4C13andheavychainandlightchainvariablefragments(VH,VL)plifiedbyoverlapPCRandacceptedbyGenbankofNCBI.VHandVL.Theb

4、iologicalactivitiesofScFvobtainedfrom293TcellculturefluidsinfectedbyliposomeberofVHandVLgenesofantiricinneutralizingmonoclonalantibodyesdilutionLinanicedoseeffectrelation.CONCLUSION:ThenicebiologicalactivitiesofScFvhaveestablishedanimportantbasementforfurther

5、studyofotherantiricinneutralizingmonoclonalantibodybasedantidotes.　　【Keyonoclonalantibodies;geneexpression;ScFv　　0引言　　自“9.11”事件后,世界各国开始高度关注生物制剂的恐怖袭击.在《禁止化学武器公约》中，ricin为最严格的控制对象之一.同时，ricin也是一种被外军武器化的蛋白毒素，美军把ricin作为化学武器的代号为109，BL21，真核表达载体pCDNA3.1，293T细胞均为本室保存；限

6、制性内切酶：EcoRI及HindIII购自Neer和TEasy载体试剂盒为Promega公司产品；TRIzolReagent购自Invitrogen公司；DNA片段回收试剂盒,DNA末端连接酶（TdT）,TaqDNA聚合酶,DNA分子量标准DL2000购自TaKaRa公司；焦炭酸二乙酯（DEPC）为Sigma产品；Lipfectamine2000为GIBCO公司产品；DMEM培养基、胎牛血清、羊抗鼠IgG多抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG由本室提供.用BIOSUN软件设计引物，由上海博亚生物技术公司合成.信号肽

7、来自本实验室解志刚博士提供的杂交瘤细胞Mt84.66.　　1．2方法　　1.2.1PCR引物主要用于扩增抗体IgG1重链Fd部分(VH+CH1)；轻链κ链(VL+CL)的全长基因.　　1.2.2RNA的提取及RTPCR取生长状态良好的4C13杂交瘤细胞(5×106/mL)，用TRIzol提取总RNA，取1μg含总RNA的溶液，依次加入AMV5×缓冲液4μL，Oligo(dT)（500ng/μL）0.5μL，2.5mmol/LdNTP2μL，Rnasin(50U/μL)0.5μL，去离子水补至20μL，反转录酶2~5

8、U，42℃延伸1h.95℃变性5min，置冰浴中，产物为cDNA第一链.PCR参数：95℃变性2min，94℃1min，55℃1min，72℃1min，30个循环，最后72℃延伸10min.　　1.2.3用于扩增ricin单链抗体的引物以VHlinkerVL的顺序通过两对特异性引物,用重叠延伸PCR用（GGGGS）3连接VH和VL,并合成新