大肠杆菌o157h7小rna mcas缺失株构建及相关功能探析

《大肠杆菌o157h7小rna mcas缺失株构建及相关功能探析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、大肠杆菌0157：H7小RNAMcaS缺失株构建及相关功能探析ConstructionofSmallNon-·CodingRNAMcaSDeletionMutantofEscherichiacoli0157：H7andRelatedFunction研究生：聂佳佳专业：微生物学导师：朱国强教授扬州大学兽医学院2014年6月聂佳佳：大肠杆菌0157：H7小RNAMcaS缺失株的构建及相关功能探析大肠杆菌O157：H7小RNAMcaS缺失株的构建及相关功能探析硕士生：聂佳佳IIUlIIIIIlUlIIIIIII1111IIl导师：朱国强教授Y2632661摘要大肠杆菌O

2、157：H7属于肠出血性大肠杆菌(EnteroheamorrhagicEcoli，EHEC)，可引起人出血性结肠炎，有时并发溶血性尿路综合症。多年来，曾在美国、日本、加拿大、欧洲等国家和地区多次爆发，造成严重危害，因此，肠出血性大肠杆菌0157：H7为重要的食物源病原菌，其感染成为威胁人类健康的全球性公共安全问题，引起全球极大关注。细菌中的sRNA已被证明是许多基因调控通路中的重要组成部分。细菌进入宿主消化道后，处在适宜的生长环境状况下，并开始在肠道中定植，从周围环境中捕获、整合相关信息，并通过一定的途径传导信息来调控和导致细菌致病毒力基因的表达，从而对宿主造成伤

3、害。其中，在信息传导过程中细菌sRNA起着非常重要的调节作用。对细菌sRNA的作用机制以及其对细菌毒力和致病机制的影响进行研究是目前一个热点问题。本实验靶向细菌小RNAMcaS对肠出血性大肠杆菌0157：H7致病力方面的影响。1大肠杆菌0157：H7sRNAMcaS缺失株及回补株构建本实验根据大肠杆菌MG511mcaS的基因序列设计一对引物，PCR扩增和克隆了大肠杆菌0157：H7的mcaS基因，通过Red同源重组系统对大肠杆菌0157：H7mcaS基因进行缺失敲除，构建出大肠杆菌0157：H7AmcaS缺失株。并通过表达mcaS基因的重组质粒pACYCl84一m

4、caS构建，以及转化入大肠杆菌0157：H7，成功构建出回补株0157：H7AmcaS／pmcaS，体外重组表达mcaS基因，为mcaS基因功能的研究提供奠定一定的基础。大肠杆菌0157：H7mcaS基因缺失株具体构建程序为：以质粒pKD3为DNA模板，设计mcaS基因缺失株引物Pl、P2，PCR扩增出含氯霉素抗性、且具有和mcaS基因上下游序列同源的融合PCR片段，纯化后电转化入大肠杆菌0157：H7野生株中，在野生株中重组质粒pKD46表达的三种重组酶的共同作用下，融合PCR片段与细菌染色体上mcaS基因发生同源片段重组，基因cat替换目标基因mcaS，在含有

5、氯霉素抗性的LB平板上筛选出mcaS基因缺失且具有氯霉素抗性的阳性重组茵0157：H7AmcaS：：cat，在此基础上利用质粒pCP20编码的Flp重组酶进行二次重组，去除重组菌携带的氯霉素抗性基因，得到大肠杆菌0157：H7mcaS基因的缺失株0157：H7AmcaS。用PCR扩增鉴定和测扬州大学硕士学位论文序检测构建的缺失株0157：H7AmcaS，验证缺失株构建成功。以大肠杆菌0157：H7野生株为模板，PCR扩增出mcaS基因序列，在PCR序列两端引入BamHI和Sail两个酶切位点，利用该两个酶切位点将mcaS基因克隆到表达载体pACYCl84上，构建重

6、组表达质粒，并转入缺失株0157：H7△mcaS，成功构建回补株0157：H7△mcaS／pmcaS。运用Red同源重组技术成功构建出0157：H7mcaS基因缺失株和回补株为进一步试验奠定基础。2运用qRT-PCR方法探究基因mcaS缺失后对其上下游基因表达量的影响本实验运用qRT-PCR的方法探究mcaS基因的缺失对其上下游基因表达的影响。其具体步骤为：首先采用Trizol法分别抽提大肠杆菌0157：H7野生株，mcaS基因缺失株以及回补株的总RNA。然后运用反转录试剂盒PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser消除提取产物中可

7、能含有基因组DNA，并对RNA进行反转录以合成cDNA，基于cDNA模板，利用qRT-PCR引物(根据GenBank基因库中发表的大肠杆菌gapA基因，mcaS上下游基因abgR和ydaL的序列设计引物，由Invitrogen公司合成)进行PCR鉴定，鉴定无误后，运用TaKaRa公司的SYBRPremixExTaqlI荧光定量PCR试剂盒进行qRT-PCR检测。结果显示，在野生株、mcaS缺失株以及回补株中，mcaS上下游的基因即abgR和ydaL在RNA水平表达量没有明显变化，排除了由于mcaS基因缺失对上下游基因的影响，为后续试验探究sRNAMcaS的功能排除

8、干扰，提高