人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株skov-3taxol的建立及其耐药机制研究

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1、人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株SKOV-3/Taxol的建立及其耐药机制研究石动菊开封市祥符区第一人民医院摘要：R的:建立紫杉醇耐药细胞株SKOV-3/Taxol,探讨卵巢癌紫杉醇获得性耐药潜在的分子机制。方法：以人卵巢癌细胞株SK0V-3为亲本细胞，采用紫杉醇(Taxol)浓度梯度递增法诱导建立卵巢癌紫杉醇耐药细胞株SKOV-3/Taxol。光学显微镜及电子显微镜观察细胞形态，MTT法检测细胞药物敏感性，流式细胞术检测细胞周期分布及细胞凋亡水平，实时荧光定量PCR和WesternBiol方法分别检测多药耐药基因以及凋亡和细胞周期调控相

2、关基因的转录和翻译水平。结果:建立的紫杉醇耐药细胞株SKOV-3/Taxol对紫杉醇具有显著耐药性，对阿霉素及5-氟服卩密碇(5-FU)也产生强烈的交叉耐药，细胞形态也发生明显的变化。与亲木细胞相比，SKOV-3/Taxol细胞G2/M阻滞明显低于SKOV-3,其凋亡率也显著低于SKOV-3,差异均有统计学意义(P<0.05),耐药细胞株中MRPKMAP-Tau和CDK1基因表达水平显著提高。结论:成功建立人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株SKOV-3/Taxol的基础上，多药耐药相关蛋口MRP1、微管相关蛋口MAP-Tau以及细胞周期蛋白

3、依赖性激酶1(CDK1)基因过表达与卵巢癌细胞对紫杉醇耐药有关。关键词：紫杉醇;多药耐药;卵巢癌;SKOV-3/Taxol细胞株;MRP1;作者简介：石动菊，女，主治医师，从事妇产科临床工作紫杉醇(PacliTaxol,Taxol)是从红豆杉树皮中提取的一种抗肿瘤药物£］J_,它对大多数实体瘤尤其对晚期卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等具有显著的抗癌活性，对卵巢癌［2,3］、子宫颈癌、肺癌和H血病等恶性肿瘤也有一定疗效，但耐药的产生极大地限制了其临床疗效和应用范围。紫杉醇的作用靶点是构成细胞骨架的微管，主要通过促进微管蛋白迅速合成微管

4、及阻止其解聚，将肿瘤细胞阻遏在G2期和M期，从而抑制其有丝分裂，最终导致肿瘤细胞死亡如。目前紫杉醇耐药细胞株的体外研究主要集中在乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、食管癌和肝癌等，而卵巢癌紫杉醇耐药的体外研究较为少见。为此，本文拟采用浓度梯度递增法建立紫杉醇耐药细胞株SKOV-3/Taxol,并对其生物学特性进行研究，以进一步探讨卵巢癌细胞中紫杉醇获得性耐药发生的新机制。报告如下。1资料与方法1.1细胞株实验采用的SK0V-3细胞株购自中国科学院上海细胞库。SKOV-3/Taxol为本室釆用紫杉醇浓度梯度递增法诱导建立的卵巢癌

5、耐药细胞株，能在含紫杉醇浓度为0.7Pmol/L和1.5ymol/L的培养基中长期稳定生长的细胞分别被命名为SKOV-3/Taxol0.7和SKOV-3/Taxol1.5。1.2细胞培养人卵巢癌细胞株SKOV-3培养于含10%胎牛血清、50U/mL青霉素、100U/mL链霉素的PRMI-1640培养液中，于37°C含5%C02培养箱屮培养，用0.25%牒蛋白酶消化传代，3d传代1次，取对数生长期细胞进行实验。1.3观察方法通过倒置显微镜和荧光显微镜观察细胞形态学变化并照相。收集培养的细胞用4°C预冷的2%戊二醛固定2h,再用0.二

6、甲神酸钠缓冲液换液3次，每次2h。Z后用1%娥酸4。C固定2h,用0.1M二甲不巾酸钠缓冲液换液2次，每次15mino接着梯度酒精脱水，环氧丙烷渗透，包埋，制备超薄切片，透射电镜观察细胞超微结构。1.4流式细胞仪检测用碘化丙锭(PT)4°C避光染色30min,300目尼龙筛网过滤后，用BDAccuriC6流式细胞仪进行测试，以488nm为激发光源检测细胞，用MODFITLT3.0软件分析比较细胞周期分布变化。细胞凋亡检测按美国BD公司AnnexinV-F1TC/P1细胞凋亡双染试剂盒说明书进行。1.5实时荧光定量PCR法检测Tri

7、zol法提取SKOV-3和SKOV-3-Taxol细胞总RNA,RT-PCR试剂盒逆转录制备cDNA,进行PCR扩増。2-AACT法计算mRNA的相对表达量，以GAPDII作为内参。每个实验组重复3次。1.6Westernblot应用RIPA细胞裂解液裂解齐组细胞，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，加入一抗并于4°C孵育过夜。二抗(1:10000),37°C孵育1h,再次TBST洗3次，用ECL增强化学发光显色系统显色。1.7统计学方法久土'所有定量实验均重复3次，实验数据以一表示，数据用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析，P<0.

8、05为差异有统计学意义。2结果2.1SKOV-3/Taxol耐药细胞模型的建立MTT检测结果表明，SKOV-3/Taxol对紫杉醇具有显著耐药性，SKOV-3/Taxol0.7与SKOV-3/Taxoll.5对紫杉醇的耐药指数分别为31.38和42