基于bac-to-bac系统研究bmspr基因在昆虫细胞的表达

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1、万方数据万方数据摘要墨蝶呤还原酶（SPR）是生物体内催化GTP分解代谢合成四氢生物蝶呤（BH4）最后一步反应的关键酶。对SPR的研究主要集中在高等脊椎动物，在昆虫中的研究报道不多。我们的前期研究表明家蚕（Bombyxmori）的SPR基因（BmSpr）是决定黄体色突变体（lem）的遗传基因，家蚕具有与哺乳动物相似的BH4从头合成途径。墨蝶呤(SP)是形成昆虫体表色的内源性色素之一，也是GTP分解代谢途径的中间产物，大量沉积于lem蚕幼虫的体表。SP也可在SPR和二氢叶酸还原酶（DHFR）的催化作用下经补救途径合成

2、BH4。作为芳香族氨基酸羟化酶和一氧化氮合酶的重要辅助因子，BH4的缺乏不仅可以引发苯丙酮尿症等生理代谢疾病，而且能够致使多种神经性代谢综合症，同时也是导致高血压、动脉粥样硬化、糖尿病等内皮功能异常的重要原因。本实验室近两年已经研究了BmSPR的原核表达及酶活特征，试图以从lem蚕幼虫提纯的SP为底物，通过共表达BmSPR和BmDHFR，建立体外合成BH4的实验体系。本研究首先利用在线分析软件对BmSPR的疏水性、信号肽、亚细胞定位、功能结构域以及蛋白高级结构进行了全面的生物信息学分析和预测。其次，利用Bac-t

3、o-Bac昆虫杆状病毒表达系统，在两种昆虫培养细胞BmN和Sf9中进行了BmSPR的真核表达研究及重组蛋白的鉴定。在Bac-to-Bac表达实验中，首先将BmSpr克隆到杆状病毒表达载体pFastBacHTB中，获得了重组质粒pFastBacHTB-BmSpr，再将该重组质粒分别转化到含有不同杆状病毒粒子（Bacmid）的AcMNPV和BmNPV的DH10Bac感受态细胞株。在含有能够表达转座酶的辅助质粒DH10Bac的细胞中完成同源重组，获得了重组杆状病毒，分别命名为pAc-BmSpr和pBm-BmSpr。经过

4、验证所获得重组Bacmid准确无误后，参照Lipofectamine2000的说明书，以脂质体介导法用重组BacmidpAc-BmSpr和pBm-BmSpr分别转染相应的宿主细胞Sf9和BmN。通过多次感染，获得较高的病毒滴度后，大量感染宿主细胞，以收获重组目的蛋白BmSPR。SDS-PAGE和WesternBlot的检测结果表明，重组蛋白BmSPR在两种昆虫细胞中都能够稳定地表达。Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统具有高效安全性，并能获得生物学活性完全的目的酶蛋白。本研究为今后利用该表达系统大量表达和纯化

5、重组BmSPR，进一步开展BH4体外制备的应用基础研究奠定了必要的实验基础。关键词：墨蝶呤还原酶，生物信息学，Bac-to-Bac表达系统，昆虫细胞I万方数据AbstractSepiapterinreductase(SPR)isakeyenzymetosynthesizetetrahydrobiopterin(BH4)fromGTPatthelaststep.StudiesonSPRaremainlyinhighervertebratesbutrarelyininsects.Wehavepreviouslyclo

6、nedthegeneofSPRinthesilkwormBombyxmori(BmSpr)andmadeitknownthatBmSprisresponsibleforthephenotypeoflemom(lem,ayellowbodycolorlarvalmutant)anddenovobiosynthesisofBH4issimilarbetweenmammalsandB.mori.Sepiapterin(SP)isoneofendogenouspigmentstoformthebodycolorofins

7、ects,whichiscontainedintheintegumentoflemlarvaeinhighconcentration.BH4canalsobesynthesizedfromSPbythecatalysesofSPRanddihydrobiopterinreductase(DHFR),calledsalvagesynthesispathway.BH4isanessentialcofactorforaromaticacidhydroxylasesandnitricoxidesynthetase,def

8、iciencyofwhichhasbeenassociatedwithmanyneuropsychologicaldisorders,hypertension,diabetes,atherosclerosisandotherdiseases.Recently,SPextractionandpurificationfromlemsilkworms,prokaryoticex