下调mir-221222在人乳腺癌mcf-7细胞中的表达可抑制肿瘤细胞的增殖及迁移能力

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1、万方数据论文题目：下调miR-221／222在人乳腺癌MCF．7细胞中的表达可抑制肿瘤细胞的增殖及迁移能力答辩委员会主席：吕志民教授答辩委员会成员：吕志民教授岑东教授奚廷斐教授论文答辩日期：2014年5月26日万方数据目录中英文缩略词对照表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯10实验结果⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯30分析与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯39实验小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯42附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯47致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯48综述及参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯49独创性声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61万方数据温州医科大学硕士学位论文中英文缩略词对照表万方数据温州医科大学硕士

3、学位论文2万方数据温州医科大学硕士学位论文下调miR-221／222在人乳腺癌MCF．7细胞中的表达可抑制肿瘤细胞的增殖及迁移能力中文摘要目的：为了探讨microRNAs(miRNAs)在人类乳腺癌中的调控作用，本研究利用反义DNA技术敲低miR-221／222的表达从而调节其靶基因组织金属蛋白酶抑制剂(TIMP3)，以便研究其对人乳腺癌MCF．7细胞系的增殖和迁移能力的影响以及其分子生物学作用机制，为乳腺癌的进一步临床治疗研究提供一些新的基础理论依据。方法：1．构建低表达miR-221／222的稳定细胞株依据miRBas

4、e数据库中hsa．miR-221、hsa．miR-222的寡核苷酸序列和一段无义序列，分别设计并重组成质粒AS-miR-221(antisense-miR-221即反义抑制miR．221)、AS．miR-222(antisense．miR-222即反义抑制miR-222)和Scramble(无义抑制)，并将其分别使用脂质体(Lipofectamineaml2000)转染人乳腺癌MCF．7细胞，然后经过G418抗性筛选后建立稳定表达的对照组(Ctrl．、Scramble)细胞株、低表达miR-221和／或miR．222组(即

5、AS-miR-221、AS—miR-222和AS—miR-221／222)细胞株。转染后于荧光显微镜下检测转染效率；逆转录PCR检测各组稳定表达细胞株中质粒载体上携带的抗性neo基因的表达情况，验证转染是否成功；Westernblot检测各组稳定表达细胞株中靶蛋白TIMP3的表达情况，验证转染是否整合。2．在稳定低表达细胞模型的基础上进行机制研究进行逆转录PCR、Real．timePCR、Westernblot等检测转染细胞株中miR．221、miR-222、TIMP3mRNA和ADAMl7的表达差异。3．在稳定低表达细胞

6、模型的基础上进行功能实验采用CCK．8实验检测并绘制生长曲线观察低表达miR-221和miR-222组细胞的生长能力；划痕修复实验观察转染后细胞的迁移能力。结果：转染24小时之后，在荧光显微镜下观察到各转染组细胞的绿色荧光蛋白表达较多，即转染效率较高；转染后检测各组细胞株中neo基因和靶蛋白TIMP3万方数据温州医科大学硕士学位论文的表达：与对照组比较，l'leo基因和TIMP3蛋白表达明显升高，即证实反义抑制的低表达稳定细胞株构建成功。与Scramble组细胞表达情况相比较，各低表达miR-221／222(AS-miR-

7、221、AS．miR-222、AS—miR-221／222)组细胞株中miR-221、miR一222的表达量降低，进一步说明质粒构建成功且发挥了抑制miRNAs表达的功效；TIMP3mRNA水平的表达是升高的，而其调控的金属蛋白酶(ADAMl7)的水平是降低的；生长曲线显示各低表达miR．221／222组细胞的生长能力明显受到抑制，划痕结果显示各低表达miR-221／222组细胞的迁移能力是降低的。结论：本研究成功构建了低表达miR-221／222的稳定细胞株；并利用功能实验证实，敲低miR-221／222后可以通过上调T

8、IMP3表达来抑制人乳腺癌MCF一7细胞系的增殖和迁移能力。关键词：miR-221；miR-222；人乳腺癌MCF．7细胞；转染；组织金属蛋白酶抑制剂3；靶基因；金属蛋白酶174万方数据一温州医科大学硕士学位论文——————————————————————————————————————————————