一个新克隆的microrna调节破骨细胞分化的作用及机制研究

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1、万方数据中图分类号R58UDC610学校代码10533八年制博士学位论文一个新克隆的microRNA调节破骨细胞分化的作用及机制研究CloningandfunctionalstudyofanovelmicroRNAregulatingosteoclastdifferentiation作者姓名’：梁梦柯学科专业：临床医学研究方向：内分泌与代谢病学学院(系、所)：湘雅二医院指导教师：罗湘杭教授论文答辩日期堡!：三：聋答辩委员会主中南大学二。一四年五月万方数据学位论文原创性声明㈣辨本人郑重声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致

2、谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。作者签名：兰幽学位论文版权使用授权书本学位论文作者和指导教师完全了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版；本人允许本学位论文被查阅和借阅；学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、．缩印或其它手段保存和汇编本学位论文。保密论文待解密后适应本声明。作者签名：望

3、翌塑导师签名匠竺万方数据摘要一个新克隆的mieroRNA调节破骨细胞分化的作用及机制研究第一部分一个新mieroRNA的克隆及其在破骨细胞分化过程中作用的研究目的：筛选新的小鼠破骨细胞特异性表达或优势表达的microRNA，研究其在小鼠体内不同组织和细胞的表达谱及在破骨细胞分化过程中的作用。方法：将小鼠原代成骨细胞与骨髓细胞共同培养获得原代破骨细胞，分离并克隆细胞内所有小RNA，并与已知的小RNA进行比对鉴定了一个新的microRNA，提交miRBase数据库注册后命名为miR-9718；应用NorthernBlot测定小鼠不同组织及细胞miR-9718的表达情况；用M．CSF联合RANK

4、L诱导RAW264．7细胞向破骨细胞分化，用NorthernBlot及qRT-PCR测定miR-9718在RAW264．7细胞向破骨细胞分化过程中的表达模式；用pSilencer4．1．CMV载体构建miR-9718表达载体pre．miR-9718，并转染RAW264．7细胞，建立miR-9718过表达细胞模型，加入RANKL及M．CSF诱导其向破骨细胞分化，提取细胞总RNA用qRT-PCR法测定破骨细胞特异性标记物TRAP及NFATc1的mRNA表达水平，并行TRAP染色观察破骨细万方数据胞分化成熟情况；用2’甲氧基修饰的反义寡核苷酸anti—miR-9718转染RAW264．7细胞，构

5、建miR-9718表达抑制模型，qRT-PCR法测定破骨细胞分化过程中TRAP及NFATcl的mRNA表达水平，并行TRAP染色观察破骨细胞分化成熟情况。结果：(1)在小鼠原代破骨细胞中克隆了一个新的microRNA，提交miRBase数据库注册后命名为miR-9718；(2)发现miR-9718选择性在破骨细胞及骨组织中高表达，而在小鼠其它组织和成骨细胞中几乎不表达；(3)RANKL及M．CSF诱导RAW264．7细胞向破骨细胞分化过程中，miR-9718的表达逐渐增加；(4)用pSilencer4．1一CMV载体成功构建了MiR-9718表达载体，并转染RAW264．7细胞，North

6、ernBlot证实RAW264．7细胞中miR-9718表达升高；(5)与对照相比，pre—miR-9718转染的RAW264．7细胞经RANKL及M—CSF诱导分化后，破骨细胞分化标记物NFATcl和TRAP的mRNA表达水平升高，TRAP阳性多核巨细胞数目显著增多；(6)与对照相比，anti．miR-9718转染的RAW264．7细胞经诱导向破骨细胞分化后，NFATcl和TRAPmRNA水平降低，TRAP阳性多核巨细胞明显减少。结论：在小鼠原代破骨细胞中鉴定了一个新的microRNA(miR-9718)；在破骨细胞分化过程中miR-9718表达激活，支持破骨细胞的分化。关键词micro

7、RNA；破骨细胞；RAW264．7细胞；转染IlI万方数据第二部分miR-9718调控破骨细胞分化的作用机制研究目的：预测并验证miR-9718在破骨细胞分化中作用的靶基因，研究miR-9718调控RAW264．7细胞向破骨细胞分化的作用机制。方法：利用Rna22软件预测miR-9718在破骨细胞分化中作用的靶基因，筛选出PIAS3为其作用的可能靶基因；将包含预测的miR-9718结合位点的PIAS3CDS片段克隆到pG