microrna-34c在调控成骨细胞及间充质干细胞成骨分化中的作用及机制研究

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1、UDC‘Io八年制博士学位论文学校代码!Q墨三三密级公珏microRNA．34c在调控成骨细胞及间充质干细胞成骨分化中的作用及机制研究TheroleandmechanismofmicroRNA·34cduringosteogenicdifferentiationofosteoblastsandmesenchymalstemcells作者：刘媛学i{]-：}专业．研究方向：·I￡一r-{—‘rr●、、，，：商多?{盏孑‘内科学学院(系、所)：湘雅二医院指导老师：廖二元教授副指导老师：袁凌青博士论文答辩日期塑!!：篁：坐答辩委员会主中南大学二O一三年五月l原创性

2、声明删lllrrrlllfrrrrfiirrllillrlllplrllllrlllllfY2421694本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：玉堡日期：五l三年』月笪日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学

3、位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：玉遂导师签名!经：殆期：迎年—蔓月丝曰．／，)／八年制博士学位论文中文摘要第一部分MicroRNA．34c／P13K-Akt调控环路在Vaspin调控MC3T3．E1细胞成骨分化中的作用机制研究摘要背景骨质疏松(osteoporosis，OP)是一种常见的疾病，它主要表现为骨量降低和骨细微结构破坏，严重者可导致骨折发生。根据流行

4、病学统计，OP在我国人群中的发病率大约为13．2％，其治疗及预防费用给国家和社会带来了巨大的负担，因此研究骨质疏松的发病机制及影响因素具有非常重要的意义。脂肪因子是一类由脂肪细胞分泌的活性生物分子，包括脂联素、瘦素、网膜素等多个成员。研究发现多个脂肪因子在骨代谢调节中发挥着重要的作用，其中内脏脂肪特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂(Vaspin)是一种新近发现的脂肪因子，以往的研究发现它可以抑制人成骨细胞的凋亡，但是对于Vaspin在成骨分化过程中的作用尚未见报道。目的本实验旨在研究Vaspin对小鼠成骨前体细胞MC3T3-E1细胞系成骨分化的影响，并观察miR-34

5、c在此过程中的作用，从而探讨Vaspin调控成骨分化的具体机制。进一步，研究P13K．Akt信号通路在此过程中的激活并讨论其与miR-34c之间的相互作用，有助于完整阐明Vaspin调控成骨分化的机制，为骨质疏松的预防和治疗提供新的靶点。方法1．分别使用不同浓度的Vaspin干预MC3T3-E1细胞72小时或联八年制博士学位论文中文摘要合p．甘油磷酸钠(p．GP)干预20天，通过对硝基苯酚法、westernblot及放免法等方法检测成骨相关标志物的表达变化，以明确Vaspin对MC3T3．E1成骨分化的影响；2．通过microarray技术分析Vaspin干

6、预前后MC3T3-E1microRNA(miRNA)表达谱的改变，筛选可能参与了此过程的miRNA；3．通过查阅成骨分化相关文献并结合第2步结果筛选可能参与了此过程的miRNA，通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证芯片结果；4．通过向MC3T3．E1内转染mimics或者inhibitor构建miRNA过表达或低表达模型，检测在这两种模型中Vaspin对成骨分化的影响，以进一步证实miRNA的表达变化是Vaspin调控MC3T3．E1成骨分化的可能机制；5．在前人研究的基础上对miRNA的靶基因进行预测，通过向MC3T3．E1内转染miRNAmimi

7、cs或者inhibitor构建过表达或者低表达模型，检测靶基因mRNA及蛋白变化以证实猜测；6．采用westernblot检测Vaspin干预MC3T3．E1各个时间点间磷酸化Akt(p．Akt)的表达变化来研究P13K．Akt信号通路在Vaspin调控MC3T3．E1成骨分化中的变化；7．利用LY294002预处理细胞阻断P13K-Akt信号通路后给予Vaspin干预，通过qRT-PCR检测miRNA表达，以研究P13K．Akt信号通路在此过程中对miRNA表达的调控作用；8．利用P13K．Akt阻断剂LY294002预处理细胞阻断P13K．Akt信号通路

8、，通过观察阻断后Vaspin对MC3T3．E1成骨相