tlr8激动剂对树突状细胞的调节及其在肿瘤免疫中的作用

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1、万方数据分类号：UDC：Rz州．I占ll，博士学位论文密级：竺立编号：一／*2718*S'olzoTLR8激动剂对树突状细胞的调节及其在肿瘤免疫中的作用作者姓名：张芸指导教师：许化溪教授小组成员：王胜军教授邵启祥教授夏圣副教授苏兆亮副教授申请学位：博士学科专业：临床检验诊断学论文提交日期：2014年l1月14日论文答辩日期：2014年12月18日学位授予单位：江苏大学学位授予日期：年月答辩委员会主席：吕力为教授基金资助：1．国家自然基金(31270947，81370084)2．江苏省教育厅(06KJB310017)万方数据学位论文版权

2、使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏大学可以将本学位论文的全部内容或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密口，在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密函。学位论文作者签名：张亥指导教师签2刀I沙年I二月；j日纱J咿年J≥月弓／日万方数据独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外，

3、本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：乡良亥日期：加l砂年l砂月弓／日万方数据江苏大学博士学位论文摘要目的：(1)利用来源于C57BL／6小鼠的树突状细胞系DC2．4，探讨联合应用人TLR8激动剂CL075和TLR7／8调节齐lJPolydT后，小鼠TLR8髓⋯．否被激活以及TLR8激活以后对TLR8以及相关细胞因子如IL．10、IL．12和TNF．a表达的影响；(2)建立小鼠肿瘤模型(Lew

4、is肺癌模型)，进一步探讨TLR8激活对肿瘤生长的影响及其抗肿瘤免疫应答的调节机制；(3)利用临床肿瘤标本(人宫颈癌组织)以及相关细胞系(人宫颈癌Hela细胞)，观察TLR8在人体癌组织的表达以及TLR8激活以后对肿瘤细胞增殖和生存的影响，以便为以TLR8为靶点的肿瘤免疫治疗提供实验和理论依据。方法：(1)在体外实验中，DC2．4细胞用含有10％小牛血清的RPMI1640培养液常规培养，光学显微镜下观察其经PBS、CL075、PolydT以及CL075与PolydT联合用药刺激后的形态学变化；RT-PCR或qPT-PCR、免疫荧光法以

5、及Westem．blot检狈JJTLR8在DC2．4的表达与分布；qPT-PCR、ELISA法检钡I]DC2．4经上述药物刺激以后相关细胞因子TNF．旺、IL．12和IL．10的表达；MTT比色法检沏]TLR8激动剂激活受体后对DC2．4抗原提呈功能的影响；qRT-PCR与WeStem．blot检测经药物刺激后对TLR8受体表达的影响。(2)在体内实验中，取纯系C57BL／6tJ、鼠，22．24克，雄性，随机分成三组，每组10R。小鼠右侧腹壁消毒后，皮下注射Lewis肺癌细胞3．0×106个细胞／只，建立Lewis肺癌小鼠模型。Lew

6、is细胞接种于小鼠当天即开始给药，PBS、CL075并BPolydT均经腹腔注射给药。CL0750．2ug+PolydT5ug(低剂量组)每天给药一次，PBS组、CL0752lag+PolydT501．tg(高剂量组)每两天给药一次。接种Lewis肺癌细胞第l天后，隔天用电子天平测量小鼠体重一次，7天后，用脱毛剂对各实验组小鼠进行脱毛，观察肿瘤的生长情况。肉眼观察并按摸皮下结节，用游标卡尺隔天测量1次肿瘤结节的长径a及短径b，单位mm，根据公式v=1／2×a×b2估算肿瘤体积。给药后第二十一天，在麻醉状态下断颈处死小鼠，取出肿瘤组织，

7、用电子天平称重，计算每组平均瘤重，qRT-PCR检测小鼠万方数据TLR8激动剂对树突状细胞的调节及其在肿瘤免疫中的作用脾脏及引流淋巴结中TLR8、IL．12、TNF．仪、IL．10、TGF．p$HFoxp3的表达，FCM检测小鼠脾脏及引流淋巴结中CDllc+细胞TLR8的表达，FCM检测小鼠脾脏及引流淋巴结qbCD3+CD8。IFN-丫+T细胞、CD3+CD8+IFN-丫+T细胞以及CD4+CD25+Foxp3+T细胞的比例。(3)临床标本分析采用病人宫颈癌组织，并结合宫颈癌细胞系进行相关验证工作。人宫颈癌细胞系Hela细胞用含有10

8、％小牛血清的DMEM培养液培养。采用RT-PCR／qRT-PCR、免疫荧光法检狈lJHela细胞TLR8的表达与分布，流式细胞术、MTTLL色法检!i贝!]TLR8激动齐JCL075对宫颈癌细胞周期和细胞凋亡的影响，qR