ⅱ型糖尿病bks-dbdb小鼠角膜病变评估及其相关信号通路的研究

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1、II型糖尿病BKS—db／db小鼠角膜病变评估及其相关信号通路的研究摘要目的：本研究采用24周龄的II型糖尿病BKS．db／dbd、鼠及BKS—db／+对照小鼠，观察其角膜病理改变，评估其角膜病变是否与临床糖尿病角膜病变相吻合，并进一步通过全基因组表达谱芯片比较糖尿病小鼠与对照组小鼠角膜组织基因的差异表达。方法：选用24周龄的BKS—db／dbd"鼠及其对照小鼠，应用裂隙灯、角膜共聚焦显微镜及角膜知觉仪等评估角膜上皮、神经纤维分布、角膜知觉的变化。收取小鼠眼球或角膜，用于组织病理学检查、免疫组化、全角膜神经染色、WesternBlot、

2、RT—PCR或基因表达谱芯片检测。表达谱芯片数据经GENESPRINGl2．0软件进行标准化及差异表达筛选后，挑选出的差异基因用DAVID(theDatabaseforAnnotation，Visualization，andIntegratedDiscovery)数据库中的GO(GeneOntology)乘lpathway数据库进行功能注释，并进一步选取差异表达基因行RT，PCR验证。结果：与BKS．删十小鼠比较，24周龄的II型糖尿病BKS．db／dbd、鼠一致维持高血糖、高糖化血红蛋白、多饮、多食、多尿等糖尿病基本体征；BKS．db

3、／dbd、鼠角膜1％虎红染色呈弥漫性片状着色，荧光素钠染色角膜呈点状着色、上皮损伤愈合延迟，组织病理及角膜共聚焦显微镜显示角膜上皮细胞形态异常，细胞凋亡染色显示上皮细胞凋亡增加：全角膜神经染色、角膜共聚焦显微镜及角膜知觉仪显示角膜神经形态异常、密度降低、角膜知觉减退；免疫组化及WesternBlot提示BKS．db／dbd、鼠角膜中氧化亚硝酸盐表达增多、MIP2表达增多及P物质表达降低。基因表达谱芯片数据分析发现，共有2423条差异表达基因(1125条上调，1298条下调)，应用DAVID数据库对差异表达基因进行功能注释，GO—BP进程

4、中，发现上调占优势的基因主要富集于“wnt受体信号通路”及“磷酸盐代谓}过程”，而下调占优势的基因主要富集于“DNA损伤修复”、“DNA重组”、“DNA代谢进程”、“细胞分裂”、“细胞周期”及“细胞增殖”等：在GO．CC中，发现上调占优势的基因主要富集于“神经元突触”，而下调占优势的基因主要富集于“细胞突触”及“线粒体”；在Pathway信号通路中，发现上调占优势的基因主要富集于“Wnt信号通路”，而下调占优势的基因主要富集于“DNA重组”及“同源重组”。结论：24周龄II型糖尿病BKS—db／dbd、鼠～致维持糖尿病的基础代谢体征，在

5、其24周龄时眼部体征表现为角膜神经纤维形态异常、密度降低及角膜知觉减退，角膜上皮结构、功能异常及角膜上皮损伤愈合延迟，24周龄的II型糖尿病BKS．db／db小鼠表现出的角膜病变与临床上II型糖尿病患者所表现出的角膜症状相吻合，所以24周龄的II型糖尿病BKS．db／db4,鼠可以迸一步作为用来研究II型糖尿病角膜病变的动物模型。在糖尿病性角膜病变中，表达谱芯片数据分析提示线粒体功能异常、Wnt信号通路被激活、DNA损伤修复能力下降、细胞增殖、分裂能力下降，能从基因水平合理的解释糖尿病性角膜病变。此外，本研究发现氧化亚硝酸盐代谢异常及W

6、nt信号通路激活，他们可能参与糖尿病性角膜病变，进一步研究亚硝化应激反应与Wnt信号通路，将会扩充对糖尿病性角膜病变机制的认识。关键词：II型糖尿病BKS．db／dbd、鼠；糖尿病性角膜病变；基因微阵列；氧化亚硝酸盐；Wnt信号通路CharacterizeandsignalingpathwayofdiabetickeratopathyintheBKSdb／dbmousemodeloftypeIIdiabetesmellitusAbstractPUlipOSE．Thisstudyseekstocharacterizediabeticker

7、atopathyintheBKSdb／dbmousemodeloftypeIIdiabetesmellitus(DM)andtoexaminedchangesinglobalgeneexpressiontodefinepathwaysregulatedbydiabetesincornea．METHODS．Cornealmorphologyandhistologyof24一week—oldBKSdb／dbanddb／+mousecorneawereevaluatedwithslitlamp，cornealconfocalmicroscop

8、yandhematoxylinandeosinstaining．cornealsensitivitywasdeterminedwithanesthesiometer．Proteinexpressionand