dkk调节wnt信号通路的结构生物学基础

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1、南开大学博士学位论文Dkk调节Wnt信号通路的结构生物学基础姓名：陈立君申请学位级别：博士专业：生物物理学指导教师：杨文修;郑翓20080401摘要Wnt信号通路在胚胎发育、细胞极化产生和细胞命运分化等过程中发挥重要作用。Wnt信号异常也与包括癌症在内的许多疾病密切相关。规范型Wnt通路的活化需要Wnt蛋白与受体Fz蛋白和共受体LI冲5／6同时结合。Dkk蛋白是规范型Wnt信号通路的拮抗剂，对于胚胎细胞命运和骨的形成非常关键。Dl(1【蛋白含有两个特征性的富含半胱氨酸的亚基，分别称为N端半胱氨酸富含亚基和C端半胱氨酸富含亚基。Dkk通过C端半胱氨酸富含亚基与LRP5／

2、6胞外13螺旋桨结构域相互作用从而抑制规范型Wnt信号通路；DkkN端半胱氨酸富含亚基不与LRP5／6结合，对C端亚基起调节作用。然而，Dkk与LRP5／6相互作用的结构学基础还不清楚。在此研究论文中，我们利用核磁共振谱学方法解析了小鼠Dkk2的N端和C端半胱氨酸富含亚基(分别称为Dkk2C和Dkl【2N)的三维结构，并研究了Dkk2C与LRP5／6胞外B螺旋桨结构域相互作用的结构生物学基础。首先，为了有效的制备重组Dkk2C和Dl她N蛋白，我们构建了硫氧还蛋白(Trx)--Dkk2C／Dkk2N融合表达载体，使其在OrigamiB菌株中高效表达。我们利用镍柱亲和层析

3、和HPLC方法纯化Dkk2C和Dkk2N蛋白，得到了折叠并具有正确生物活性的蛋白。由此，我们建立了一种从大肠杆菌中有效表达并纯化富含双硫键的蛋白的方法。我们利用高分辨率核磁共振谱学方法，解析了Dkk2C的溶液三维结构。Dkk2C属于富含二硫键的扁平的小蛋白分子，具有对称的折叠模式。Dkk2C结构含有两个由反平行p折叠组成的D片层核心区域，不同长度的柔性区域将这些13折叠连接起来，分子内的五个双硫键将整个分子紧密的折叠在一起，导致了分子的高度稳定性。以前的定点突变研究确定了Dkk和LRP5／6相互作用的可能的结合位点，以此为指导，我们利用软件HADDOCK的蛋白一蛋白对

4、接模拟计算的方法构建了Dkk2C与LRP5／6胞外三个13螺旋桨结构域(分别称为LRP5一PDl、LRP5--PD2和LRP5--PD3)相互作用的复合物结构，建立了Dkk与LRP5／6相互作用的模型。结果显示，在酸性pH条件下，Dkk2C选择性与LI冲5一PD3结合，摘要并具有最大亲和力；另外，Dl(k2C中的残基H198及其质子化状态对于Dkk2C和LI冲5一PD3的结合十分关键，提示pH在调节Dkk2C结合LRP5／6胞外D螺旋桨结构域从而抑制Wnt信号通路中发挥重要作用。最后，我们利用核磁共振谱学方法解析了Dkk2N的溶液三维结构，发现Dkk2N与Dkk2C的

5、结构具有明显的相似性。对全长Dkk2的研究表明，Dkk2C与Dkk2N在全长Dkk2分子中是相互独立的，彼此间不存在相互作用。这些研究结果不仅增加了我们对Dkk调节规范型wnt信号通路的理解而且扩展了寻找新型治疗靶点的范围，对于基础科学研究和医学治疗都具有重要意义。此外，我们还研究了芦荟大黄素对正常和细菌脂多糖(LPS)刺激的大鼠腹腔巨噬细胞(pMtp)释放耵盯．a和【ca2+】i动力学的影响。其效应表现出双向调节作用，低浓度时对【cali升高有明确的抑制作用，对TNF．仅释放的抑制呈随浓度升高而减弱的趋势。芦荟大黄素对【ca2+】i动力学的调制是其调节PM9释放TN

6、F．a信号传导通路中的重要环节。关键词：规范型Writ信号通路蛋白一蛋白对接模拟核磁共振Dkk2溶液结构Dkk--LRP5／6复合物IIAbstraetAbstractWmsignalingpathwayplaysimportantrolesinembryonicinduction,generationofcellpolarity,andspecificationofcellfate．AbnormalWntsignalingisalsoinvolvedinmanykindsofdiseasesincludingcancers．Dkkproteinsareantagon

7、istsofthecanonicalWntsignalingpathway．Dkkcontainstwocharacteristiccysteine·richdomains，termedasN-terminalandC-terminalcysteine-richdomainrespectively．WmantagonismbyDkkrequiresthebindingoftheC-terminalcysteine—richdomainofDkktothe13-propellerdomainsofⅥ协CO—receptorLRP5／6；N—termin