减味寿胎丸提取工艺及其有效成分的药动学和血清药理学研究

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1、广州中医药大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经特别加以注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名钢日期：』6修岁彤7日关于学位论文使用授权的声明本人完全了解广州中医药大学有关保留使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本

2、人授权广州中医药大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名删论文导师签名嗍◇J咿j彳曰1么Ⅳ¨吖、、、＼、摘要lIllli1IIIII}tilIIilillllllUlY2622722目的：以减味寿胎丸总黄酮含量为指标，通过单因素考察和正交设计，优化减味寿胎丸总黄酮的提取工艺；利用UPLC—MS研究减味寿胎丸总黄酮中金丝桃苷和槲皮素在大鼠体内的药代动力学参数，根据药物达峰时间，制备含药血清；原代培

3、养人早孕蜕膜细胞，建立米非司酮损伤人早孕蜕膜细胞模型，并以此为载体，观察含药血清对细胞凋亡模型的影响。方法：1．优化减味寿胎丸总黄酮的提取工艺：以芦丁为对照品，利用比色法测定寿胎丸提取液中的总黄酮含量，采用单因素考察及正交试验设计法优选减味寿胎丸中总黄酮的回流提取工艺参数。2．UPLC-MS同时测定减味寿胎丸中金丝桃苷和槲皮素：通过优化色谱条件和质谱条件，建立UPLC-MS方法，同时检测减味寿胎丸提取液中的金丝桃苷和槲皮素。3．大鼠血液中减昧寿胎丸的金丝桃苷和槲皮素药代动力学研究：(1)优化液质联用条件，建立同

4、时检测大鼠血浆中减味寿胎丸的金丝桃苷和槲皮素的UPLC-MS方法。(2)SD雌鼠随机分为3组，每组6只，分别灌予减味寿胎丸、金丝桃苷和槲皮素，灌药后分别在5min、lOmin、20min、30min，45min、60min、90min、120min、240min、360min从眼眶静脉丛采血0．5ml，分离得血浆，采用乙酸乙酯液一液提取方法进行样品预处理，己烯雌酚作为内标。应用优化好的UPLC—MS方法测定大鼠血浆中金丝桃苷和槲皮素的含量，获得药时曲线和药动参数。4．人早孕蜕膜细胞凋亡模型的建立：应用复合酶消化

5、法分离人早孕蜕膜细胞，利用差时贴壁法纯化人早孕蜕膜细胞。施加不同浓度的米非司酮于人早孕蜕膜细胞，通过细胞抑制率、早期凋亡率、caspase-3基因表达3个指标评价人早孕蜕膜细胞凋亡的情况，确定适合造模的米非司酮浓度。5．减昧寿胎丸及其有效成分含药血清对人早孕蜕膜细胞损伤模型的影响：SD雌鼠随机分为6组，每组5只，分别予地屈孕酮、减味寿胎丸、菟丝子、金丝桃苷、槲皮素、生理盐水灌胃，约在药物达峰时间用10％水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉采血，分离得到含药血清。选取纯度大于90％生长状态良好的人早孕蜕膜细胞，予造模浓度的

6、米非司酮干预后，施加制备好的含药血清干预造模细胞，通过MTT法、流式细胞术、PCR和免疫印迹检测相关指标，以观察含药血清对细胞模型的影响。结果：1．减味寿胎丸总黄酮的测定方法简单可靠，标准曲线为：y=1．205x，r=O．9998，芦丁0．112～O．56mg／mL范围内线性良好。通过单因素考察和正交试验设计得出回流提取减味寿胎丸总黄酮的最佳条件为：乙醇浓度为60％，料液比为1：10，回流提取2次，每次提取时间为0．5h。2．建立了同时检测减味寿胎丸中的金丝桃苷和槲皮素的UPLC—MS方法，标准曲线r>O．99

7、9，在0．25ug／ml一4ug／ml范围，线性关系良好，精密度、回收率等均符合要求，测得减味寿胎丸提取液中的槲皮素和金丝桃苷分别为O．15mg／ml和1．98mg／ml。3．血浆中金丝桃苷和槲皮素分别在5-5000、卜1000ng／mL范围内线性关系良好(r2≥0．9954)，最低定量限(LLOO)≤5ng／mL。日内、日间精密度的相对标准偏差(RSD)均小于8．2％，相对误差(RE)为一5％～6％。平均提取回收率为71％～83％范围内，基质效应其均值处于94％一--99％范围内。大鼠口服灌胃后金丝桃苷和槲皮

8、素吸收快，Tmax均小于60min。从药一时曲线可见复方组中的Cmax较单体组的高，生物利用度较高。4．复合酶法分离得到人早孕蜕膜细胞，通过差时贴壁法纯化至第3代，荧光免疫法鉴定角蛋白7为阴性，波形蛋白为阳性，泌乳素为阳性，纯度大于90％；放射免疫法测定第卜10代细胞上清液均含有PRL，在第8代后细胞上清中PRL呈现递减趋势。在生长旺盛期，施加5个不同浓度的米非司酮，MTT法检测生长抑