两种药用植物响应光酶诱导次生代谢关键酶活性的研究

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1、厥论文作者签名：指导教师签名：论文评阅人l：评阅人2：评阅人3：评阅人4：评阅人5：答辩委员会主席：宣尧地委员1：夏灵委员2：固基奎委员3：处莲麴委员4：委员5：浙江大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得迪太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者躲夺啦签字啸啡年；月侈日学位论文版权使用

2、授权书本学位论文作者完全了解浙堑太堂有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权浙婆太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：銮文府签字日期：凹件年寻月D日一名：￥量专签寄蹴易，￥年弓其多日致谢庄子日：“人生天地间，若白驹过隙，忽然而已。”转眼间，两年半的硕士生涯就要过去了，依旧是不舍，在论文即将完成之际，我的心情很激动，从开始进入课题到论文的顺利完成，有多少可敬的

3、师长、同学、朋友给了我无言的帮助，在这里请接受我诚挚的谢意!首先我要深深感谢我的导师田景奎教授，他严肃的科学态度，严谨的治学精神，精益求精的工作作风一直是我工作、学习中的榜样；他循循善诱的教导和不拘一格的思路给予我无尽的启迪；两年多来，田老师不仅授我以文，而且教我做人，虽历时三载，却给以终生受益无穷之道，让我养成了良好的学习和生活习惯，对田老师的感激之情是无法用言语表达的。在选题及研究过程中我也得到了孙莲莉讲师的的悉心指导。孙老师多次询问研究进程，并为我指点迷津，帮助我开拓研究思路，精心点拨、热忱鼓励。孙老师一丝不苟的作风，严谨求实的态

4、度也深深影响着我。感谢实验室的师兄师姐师弟师妹，感谢李锡敏师兄，杨丙贤师兄，郑雯师姐，李娟娟师姐，卢晓萍师姐等在实验过程中给予的指导与帮助，感谢徐婵娟师妹，任依娜师妹及其他研究组同学在生活和工作中给予的支持。这是个团结奋斗的团队，是你们在我困难的时候给与我支持，陪我度过研究生的一个个春夏秋冬。我还要感谢培养我的浙江大学，感谢她求是、创新的学风，开拓了我的视野；感谢生物医学工程与仪器科学学院，在这个温暖的大家庭里，我度过了快乐美好的时光；感谢体育舞蹈协会与默沙东俱乐部，在这里我结识了非常多的朋友。感谢我的爸爸妈妈，焉得谖草，言树之背，养育

5、之恩，无以回报，你们永远健康快乐是我最大的心愿。感谢曾经帮助和支持我的男友和一起找工作奋斗的同学们，你们无私的关心和支持是我不懈前进的动力。感谢所有曾经关心、帮助和支持过我的老师、朋友和同学们!李文婷2014年1月于求是园摘要课题组前期研究表明，应用光酶诱导技术可以显著提高药用植物体内活性成分的含量，或者产生新的高活性的次生代谢产物。本课题以圆锥铁线莲叶片和桑叶为研究对象，应用光酶诱导技术诱导圆锥铁线莲叶片产生香豆素，诱导桑叶产生桑辛素和Diels．Alder加合物。从这两种药用植物叶片中提取粗酶，分别加入香豆素和Diels-Alder

6、加合物生物合成途径的前体，辅以HPLC．DAD分析技术，确认了生物合成活性成分关键酶的存在，从酶学水平阐释了光酶诱导技术提高药用植物体内活性成分含量的作用机制。以圆锥铁线莲叶为研究对象，将离体的圆锥铁线莲叶片进行光酶诱导处理。诱导后样品在温度25℃，避光培养，时间分别为6h、12h、18h、24h和36h，对照组样品也在同样环境下培养36h。采用不同pH值的提取液从圆锥铁线莲叶片中提取粗酶，加入推测的香豆素生物合成途径的前体，进行酶促反应。当加入推测的底物p．香豆酸，7．羟基香豆素，水杨酸和苯甲酸之后，底物没有消耗，也没有合成新的化合物

7、，而当加入咖啡酸之后，体系有新的色谱峰产生；从不同时间点提取出来的粗酶的活性各不相同，但都能催化咖啡酸发生反应。催化此反应的酶在对照组的叶片中也能检测到，活性较处理组低。可以初步判断，光酶诱导圆锥铁线莲产生的三个香豆素化合物，可能是通过咖啡酸途径生物合成的，是生物合成上游的限速步骤。以桑叶为研究对象，将离体的桑叶叶片进行光酶诱导处理，诱导后样品在温度为25"C，避光培养，培养时间分别为36h，对照组的样品也在同样环境下培养。采用pH=8的提取液从桑叶中提取粗酶，加入推测的Diels-Alder加合物的生物合成途径的前体，进行酶促反应，分

8、析反应前后指纹图谱的变化，确定桑叶体内存在Diels-Alderase，光酶诱导前后桑叶提取的粗酶，加入预测的底物morachalcone和桑辛素C，在酶促反应开始的2h内，酶促反应进行非常顺利，生成了预测