鸭甲肝病毒1型一个保守的中和性线性b细胞表位的确定

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1、山东农业大学硕士学位论文鸭甲肝病毒1型一个保守的中和性线性B细胞表位的确定姓名：周国梅申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：姜世金20120613山东农业大学硕士学位论文中文摘要鸭病毒性肝炎(Duckviralhepatitis)是由鸭甲肝病毒(DuckhepatitisAvirus，DHAV)和鸭星状病毒(Duckastrovirus)弓I起的雏鸭的一种高度致死、传播迅速的病毒性疾病，主要感染1"-3周龄雏鸭，死亡率高达90％以上。其中DHAV型鸭肝炎呈世界范围分布，是对养鸭业威胁最大的一种传染病。但是

2、有关DHAV病毒蛋白功能的研究较少。本研究是在已经研制了DHAV．1单克隆抗体的基础上，通过对毒株LY0801的结构蛋白VPl及其分段的基因克隆，表达，免疫活性的检测，对具有病毒中和作用的DHAV．1单克隆抗体4F8所识别的抗原表位进行准确定位，为DHAV．1的诊断、分子流行病学调查、新型表位疫苗的研制提供科学依据。本研究主要包括以下内容：1、5株DHAV．1特异性单克隆抗体识别抗原表位的初步分析本研究通过腹腔注射小白鼠的方法制备了针对5株具有中和性能的DHAV．1的特异性单克隆抗体。以DHAV．1LY0801

3、株的cDNA为模板，通过PCR扩增DHAV．1完整的VPl基因，将其克隆入杆状病毒表达载体中，转染sf9昆虫细胞后，通过IFA确定实验室制备的5株单克隆抗体识别的抗原表位均位于DHAV．1的VPl蛋白上；Westernblot试验结果表明：单抗4F8和5G4识别的是线性表位，而单抗lEl0、4E6和5E11识别的是构象性表位。2、单克隆抗体4F8识别线性表位的准确定位研究本研究采用交叉重叠法设计引物，构建了13段VPl分段蛋白的pET-32a(+)重组表达质粒，转化到Rosetta菌株中，用IPTG诱导表达融合

4、蛋白，对表达产物SDS．PAGE蛋白质凝胶电泳确定表达后，用单克隆抗体4F8分别进行Westernblot分析，根据Westernblot结果结合引物设计推测4F8识别的抗原表位；构建表达DHAV-1不同长度VPl蛋白的杆粒，转染sf9昆虫细胞后对蛋白进行诱导表达，使用单克隆抗体4F8对转染昆虫细胞进行IFA检测。根据Westernblot和IFA检测结果，使用分子生物学软件对单克隆抗体4F8识别的抗原表位序列进行分析，结果表明，4F8识别的抗原表位是DHAV-1中VPl蛋白的74．82位氨基酸，即74SGEI

5、ILTIV82。通过与NCBI上发表的序列中DHAV各血清型病毒序列的分析发现，该抗原表位在DHAV-1高度保守，而DHAV-2和DHAV-3分离株均在该位点内存在变异。因此单克隆抗体4F8为DHAV-1的特异性单抗，可用于DHAV-1的免疫诊断。关键词：DHAV一1；单克隆抗体：VPl蛋白；抗原表位；IFA；WesternbIot鸭甲肝病毒1型一个保守的中和性线性B细胞抗原表为的确定IdentificationofaconservativelinearBcellepitopeontheVPIproteinof

6、duckhepatitisAvirustype1AbstractDuckviralhepatitisisakindofhighlycontagiousandlethalinfectiousdiseasewhichcausedbyduckhepatitisvirus．DuckhepatitisAvirustype1(DHAV-I)caninfectyoungduckmainlywithinthe3-week-oldducklings．DHAV-1wasfirstdescribedonLongIslandin194

7、9(LevineandFabricant，1950)．In1963，thediseasewasfoundedinthemainlandofChina，althoughtheviruswasnotidentifieduntil1984．Duckviralhepatitisiscausedbythreedifferentserotypes．NowDHAV-1isbecomingaworldwideindistributionandoneofthemosteconomicimportancedisease．Todat

8、e，therewerenotsuchmorereportsabouttheresearchofproteinfunctionsofDHAV．Inthisstudy，onthebasicofobtainedthewholegenomomesequenceandmonoclonalantibodiesfortheDHAV一1，structuralproteinVP1ofDHAV-1LY08