cops3基因在肝癌细胞增殖中的功能研究

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1、上海交通大学博士学位论文COPS3基因在肝癌细胞增殖中的功能研究姓名：余永胜申请学位级别：博士专业：内科学指导教师：臧国庆201204COPS3基因在肝癌细胞增殖中的功能研究摘要目的COPS3(COP9signalosomecomplexsubunit3，CSN3)基因是COP9信号复合体(COP9signalosomecomplex)的第三个亚基，位于人类17号染色体。近年来的研究发现染色体17p的扩增与p53位点的杂合子丢失、p53等位基因缺失与恶性肿瘤的发生发展有密切关系。已有研究表明，高度恶性骨肿瘤样本中可以检测到COPS3扩增及过表达。而目前

2、尚未有COPS3基因是否参与肝癌发生的报道。本研究探讨COPS3基因在肝癌发生和发展中的作用。方法采用免疫组化法，检测30例肝癌组织和30例肝硬化组织中COPS3蛋白的表达水平和细胞内定位。采用RNA干扰技术，设计COPS3基因靶向小干扰RNA序列，构建小发夹RNA(shRNA)，重组含有COPS3shRNA的慢病毒表达载体，与慢病毒包装辅助质粒共转染293T细胞，包装慢病毒，测定病毒滴度并通过WesternBlot方法验证有效的siRNA靶序列。选择最佳的siRNA序列，包装慢病毒感染SMMC．7721和Hep3B肝癌细胞，进行体外MTT、BrdU、

3、克隆形成、细胞周期、细胞凋亡检测，并建立肝癌移植小鼠模型，进行成瘤实验。为进一步探讨COPS3在肝癌细胞增殖和凋亡中的作用，利用WesternBlot方法检测凋亡相关蛋白表达，初步探讨COPS3基因调节肝癌细胞增殖的分子机制。结果免疫组化结果表明，COPS3蛋白在肝癌组织中和肝硬化组上海交通大学博士学位论文织中的表达高于正常肝组织，且肝癌组织中的表达显著高于肝硬化组织；COPS3蛋白在癌变的肝组织中主要定位于细胞核，而在正常肝组织中主要定位于细胞浆。为探讨COPS3基因在肝癌细胞生长中的作用，设计COPS3靶向shRNA序列，包装成滴度为2×108TU

4、／ml慢病毒，有效感染SMMC．7721和Hep3B肝癌细胞，并在mRNA和蛋白水平下调肝癌细胞COPS3的表达。COPS3沉默导致肝癌细胞活力，DNA合成水平、克隆形成能力显著降低，并引起细胞周期阻滞于G0／G1期，同时诱导肝癌细胞凋亡。COPS3沉默还可导致裸鼠体内肝癌移植瘤的生长减缓。此外，COPS3下调的肝癌细胞中，凋亡分子Caspase8、BIK的表达上调、PAI冲蛋白发生裂解。结论COPS3在肝癌组织中表达水平和定位均发生改变，可能参与肝癌的发生和发展过程。COPS3沉默(COPS3shRNA)可诱导肝癌细胞周期阻滞、调节Caspase8、

5、PARP和BIK的活性，促进肝癌细胞凋亡，抑制肝癌细胞增殖，结果提示COPS3基因是促进肝癌细胞生长的癌基因之一。关键词：COP9信号复合体亚单位3(COPS3，COP9signalosomecomplexsubunit3．CSN3)，肝癌，细胞增殖，细胞凋亡，RNA干扰上海交通大学博士学位论文THEROLEOFCOPS3GENEINPRoLIFERATlONoFHEPATOCELLULARCARCINOMAABSTI认CTObjective：COPS3(COP9signalosomecomplexsubunit3)geneisthethirdsubu

6、nitofCOP9(COP9signalosomecomplex)，itislocatedinhumanchromosome17．Recentstudieshavefoundthattheamplificationofchromosome17plociandlossofheterozygosityinp53gene，Lossofp53alleleiscloselyrelatedtothedevelopmentofmalignanttumors．Studieshavedemonstratedthatamplificationandoverexpressi

7、onofCOPS3canbedetectedinhighlymalignantbone，tumorsamples．WhetherCOPS3geneisinvolvedinhepatocellularcarcinomahasnotyetbeenreposed．ThepurposeofthisstudywastoexploretheroleofCOPS3geneindevelopmentofhepatocellularcarcinoma．Methods：Usingimmunohistochemistry,COPS3proteinexpressionandi

8、ntracellularlocalizationdetectedin30casesofHCCa