抑制消减杂交技术筛选人舌鳞癌(tca8113)干细胞相关基因的实验研究

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1、重庆医科大学硕士学位论文抑制消减杂交技术筛选人舌鳞癌（Tca8113）干细胞相关基因的实验研究姓名：邹波申请学位级别：硕士专业：口腔临床医学指导教师：季平201205重庆医科大学硕士研究生学位论文抑制消减杂交技术筛选人舌鳞癌(Tca8113)干细胞相关基因的实验研究摘要“肿瘤干细胞”假说认为，肿瘤组织内存在数量极少的一亚群细胞，它们与肿瘤的发生、复发或转移有密切的关系，因其具有自我更新、无限增殖等正常组织干细胞的生物特性而被称为“肿瘤干细胞”。目前已在白血病以及多种实体瘤中都证实了这一亚群细胞的存在。“肿瘤干细胞”假说为研

2、究肿瘤发生、复发及转移的分子机制提供了一个较为理想的突破口，因而成为近几年科研领域的热点。醛脱氢酶(Aldehydedehydrogenase，ALDH)被认为是肿瘤干细胞的标志物之一，在白血病以及包括头颈部鳞癌在内的多种实体瘤中都已证实醛脱氢酶活性较高的肿瘤细胞具有类似正常组织干细胞的特性，但我们尚未完全了解产生这种表型的内在机制。本实验的目的就是分选舌鳞癌Tca8113细胞株中高表达醛脱氢酶的干细胞样细胞(ALDH圻)及低表达醛脱氢酶(ALDHlow)的普通肿瘤细胞，并利用抑制性消减杂交(SSH)技术筛选ALDH叶与A

3、LDHl0W两亚群细胞中表达有差异的基因。方法1．人舌鳞癌中脱氢酶高表达细胞(ALDH时)的分选及鉴定重庆医科大学硕士研究生学位论文采用荧光激活细胞分选系统从人舌鳞癌细胞株Tca8113中分选高表达醛脱氢酶的干细胞(ALDHh)及低表达醛脱氢酶(ALDHlow)的普通肿瘤细胞，通过增殖实验、分化实验以及无血清培养实验分别鉴定两亚群细胞的生物学特性。2．人舌鳞癌(Tca8113)中高、低表达ALDH细胞差异表达基因消减文库的构建以ALDHh细胞RNA作为实验jY(Tester)，ALDHlow细胞RNA作为驱动方(Drive

4、r)构建正向文库；以ALDHh细胞RNA作为实验方(Tester)，ALDHh细胞RNA作为驱动方(Driver)构建反向文库。菌液pcr对构建的消减cDNA文库进行质量检验。3．差减cDNA文库的筛选及生物信息学分析随机挑选文库中的克隆，经鉴定有插入片段后进行高通量测序，利用NCBIBlast对测序所得序列进行比对分析；利用WebGestalt在线分析平台对比对所得候选基因进行GO分类以及信号通路分析。结果1．人舌鳞癌Tca8113细胞株中，约1．3％的肿瘤细胞醛脱氢酶活性极高，即：ALDHh细胞。该亚群细胞增殖速度快于

5、普通肿瘤细胞(即：ALDHl0W细胞)，具有自我更新能力，并可以“肿瘤球”的形式在无血清培养基中悬浮生长。2．在正、反向文库中随机挑取白色菌斑，培养后进行菌液PCR扩增。结果显示：大部分白色克隆中均有插入片段，主要分布于200～"800bp大小范围内，表明构建的消减文库符合要求。4重庆医科大学硕士研究生学位论文3．正、反向文库中随机挑选的克隆，成功测序的有226个，经同源性比对最终得到62个差异表达基因片段与已知基因的相似性极高f90％lOO％)。通路分析显示差异表达基因参与的10条信号通路发生的改变较为显著。结论1、人舌

6、鳞癌细胞株Tca8113中-,5部分高表达醛脱氢酶活性的细胞与肿瘤干细胞的生物学性质相似，醛脱氢酶(ALDH)或许是富集舌鳞癌干细胞的有效标志物。2、利用抑制消减杂交技术我们获得了一些与舌鳞癌干细胞相关的基因，为进一步研究肿瘤干细胞的生物特性以及解释人舌鳞癌发生、复发及转移的分子机制提供一定的帮助。关键词：舌鳞状细胞癌；肿瘤干细胞；醛脱氢酶；基因；抑制消减杂交重庆医科大学硕士研究生学位论文ANEXPERlMENTALSTUDYoNTHESCREENINGoFSTEMCELL-RELATEDGENESINTONGUESQUA

7、MOUSCELLCARCINOM泼TCA8113CELLSBYSUPPRESSIONSUBTRACTIVEHYBRIDIZATIoNABSTRACTInrecentyears，peoplebelievethatthecancerstemcell(csc)hypothesiscouldbeappliedtocancers．Accordingtothehypothesis，atumorcanbeviewedasanaberrantorganinitiatedbyasmallsubpopulationofcellscalledc

8、ancerstemcells(CSCs)，whichexhibitself-renewingcapacitiesandareresponsiblefortumormaintenanceandmetastasis．Thishypothesisprovidesnovelinsightintotheunder