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时间:2018-11-08
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1、hTERT—shRNA慢病毒载体构建及其抑制舌鳞癌Tca8113细胞株的体外实验研究hTERT-shRNA慢病毒载体构建及其抑制人舌鳞癌Tca8113细胞株的体外实验研究硕士研究生:杨屹强导师:丁学强教授专业:口腔颌面外科学中文摘要背景和目的:口腔鳞状细胞癌(oralsquamouscellcarcinomas,OSCC)的发病率占口腔颌面部恶性肿瘤的80%以上。最近几十年来,虽然外科治疗、化疗、放疗技术R臻成熟,但是口腔鳞癌患者的长期生存率(5年生存率50%左右)却无明显改善。即使经过系统的抗癌治疗,口腔鳞癌局部复发率仍高达30%左右1,2,
2、3o而肿瘤局部复发和远处转移往往导致治疗失败。因此,探索治疗恶性肿瘤的新手段迫在眉睫。基因治疗是最具潜力的治疗恶性肿瘤的新方法,优化基因载体的转染效率和安全性已成为目前研究的热点之一。近年来,基于人类免疫缺陷病毒(HIv)构建的慢病毒载体己发展成为一种高效的基因载体。慢病毒载体具有:转移基因片段容量大、不易诱发宿主免疫反应、可以感染不分裂细胞、稳定整合于宿主的基因组等诸多优点。RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术是转录后水平的基因沉默(post—transcriptionalgenesilencing,PTGS),已被证明
3、是极具潜力的基因治疗手段,在基础、临床研究中具有极为广阔的应用前景。恶性肿瘤的一个重要特征是细胞永生化,即肿瘤细胞具有无限增殖的潜力。端粒和端粒酶作为维持染色体的稳定的主要结构,特别是端粒酶活性的主要限速性组分:端粒酶逆转录酶催化亚基(humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)可望成为肿瘤基因治疗的理想靶标。hTERT—shRNA慢病毒载体构建及其抑制舌鳞癌Tca8113细胞株的体外实验研究本研究通过筛选出有效的靶向hTERTshRNA,将其重组、构建至慢病毒载体,感染Tea8113细胞后检测其对肿瘤细
4、胞的靶向基因沉默效率,探讨其在口腔鳞癌治疗中的应用前景。方法:1.实验检测慢病毒感染Tca8113细胞效率。2.选取本课题组前期筛选出的hTERT-1813和国外文献4报道的另一序列hTERT一3114,LipofectaminerM2000转染Tca8113细胞,96h后以WesternBlot检测hTERT蛋白表达情况,筛选出抑制效率较高的siRNA序列。3.将筛选出的siRNA表达框架构建至慢病毒载体质粒PGCL.GFP上,包装得到成熟的慢病毒颗粒Lenti.hTERT3114。4.以不同浓度的慢病毒颗粒感染Tca8113细胞,倒置相差显
5、微镜下观察慢病毒颗粒感染Tea8113细胞的情况,并绘制生长曲线。半定量RT—PCR检测hTERTmRNA表达,Westernblot检测hTERT蛋白表达情况。结果:1.本实验选用的慢病毒载体能高效感染Tca8113细胞,最佳感染条件MOI=2.5。2.脂质体转染hTERT一1813和hTERT一3114两组Tca8113细胞中,hTERT蛋白的表达得到有效抑制,抑制率分别为29.1±5.82%和56.7±2.49%。因此,选择hTERT一3114构建慢病毒载体。3.成功构建了重组慢病毒载体质粒PGCL.hTERT3114一GFP。经病毒包装
6、后,得到了携带hTERT3114的成熟的重组慢病毒颗粒Lenti—hTERT3114,病毒滴度达到了4.16x108TU/ml。4.重组慢病毒Lenti—hTERT3114感染Tca8113细胞,细胞生长受到抑制,感染第8天时,抑制率为41.7%。1周后检测其hTERTmRNA及其蛋白表达,抑制率分别为72.96±1.47%和73.60+2.01%,内参B.actin表达未受影响。结论:本实验成功构建了靶向hTERT基因的重组慢病毒载体Lemi.hTERT3114,并利用该慢病毒载体成功地将hTERT3114siRNA表达框架转导入Tea811
7、3细胞,使其持续表达,实现了靶向hTERT基因的RNA干扰。重组慢病毒载体有效地抑制了Tea8113hTERTmRNA及其蛋白的表达,抑制了Tea8113细胞的生长。通过实验,初步说明慢病毒载体介导的RNAi技术对口腔鳞癌的基因治疗具有良好hTERT—shRNA慢病毒载体构建及其抑制舌鳞癌Tca8113细胞株的体外实验研究的应用前景。关键词:口腔鳞癌;RNA干扰;慢病毒载体;端粒酶;hTERT;Tca8113细胞;基因治疗VhTERT—shRNA慢病毒载体构建及其抑制舌鳞癌Tca8113细胞株的体外实验研究Experimentalresearc
8、hofhTERT-shRNAlentiviralvectorconstructionanditssuppressionofthehumantongue
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