htert-shrna慢病毒载体构建及其抑制人舌鳞癌tca8113细胞株体外实验研究论文

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1、hTERT—shRNA慢病毒载体构建及其抑制舌鳞癌Tca8113细胞株的体外实验研究hTERT-shRNA慢病毒载体构建及其抑制人舌鳞癌Tca8113细胞株的体外实验研究硕士研究生：杨屹强导师：丁学强教授专业：口腔颌面外科学中文摘要背景和目的：口腔鳞状细胞癌(oralsquamouscellcarcinomas，OSCC)的发病率占口腔颌面部恶性肿瘤的80％以上。最近几十年来，虽然外科治疗、化疗、放疗技术R臻成熟，但是口腔鳞癌患者的长期生存率(5年生存率50％左右)却无明显改善。即使经过系统的抗癌治疗，口腔鳞癌局部复发率仍高达30％左右1,2,

2、3o而肿瘤局部复发和远处转移往往导致治疗失败。因此，探索治疗恶性肿瘤的新手段迫在眉睫。基因治疗是最具潜力的治疗恶性肿瘤的新方法，优化基因载体的转染效率和安全性已成为目前研究的热点之一。近年来，基于人类免疫缺陷病毒(HIv)构建的慢病毒载体己发展成为一种高效的基因载体。慢病毒载体具有：转移基因片段容量大、不易诱发宿主免疫反应、可以感染不分裂细胞、稳定整合于宿主的基因组等诸多优点。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)技术是转录后水平的基因沉默(post—transcriptionalgenesilencing，PTGS)，已被证明

3、是极具潜力的基因治疗手段，在基础、临床研究中具有极为广阔的应用前景。恶性肿瘤的一个重要特征是细胞永生化，即肿瘤细胞具有无限增殖的潜力。端粒和端粒酶作为维持染色体的稳定的主要结构，特别是端粒酶活性的主要限速性组分：端粒酶逆转录酶催化亚基(humantelomerasereversetranscriptase，hTERT)可望成为肿瘤基因治疗的理想靶标。hTERT—shRNA慢病毒载体构建及其抑制舌鳞癌Tca8113细胞株的体外实验研究本研究通过筛选出有效的靶向hTERTshRNA，将其重组、构建至慢病毒载体，感染Tea8113细胞后检测其对肿瘤细

4、胞的靶向基因沉默效率，探讨其在口腔鳞癌治疗中的应用前景。方法：1．实验检测慢病毒感染Tca8113细胞效率。2．选取本课题组前期筛选出的hTERT-1813和国外文献4报道的另一序列hTERT一3114，LipofectaminerM2000转染Tca8113细胞，96h后以WesternBlot检测hTERT蛋白表达情况，筛选出抑制效率较高的siRNA序列。3．将筛选出的siRNA表达框架构建至慢病毒载体质粒PGCL．GFP上，包装得到成熟的慢病毒颗粒Lenti．hTERT3114。4．以不同浓度的慢病毒颗粒感染Tca8113细胞，倒置相差显

5、微镜下观察慢病毒颗粒感染Tea8113细胞的情况，并绘制生长曲线。半定量RT—PCR检测hTERTmRNA表达，Westernblot检测hTERT蛋白表达情况。结果：1．本实验选用的慢病毒载体能高效感染Tca8113细胞，最佳感染条件MOI=2．5。2．脂质体转染hTERT一1813和hTERT一3114两组Tca8113细胞中，hTERT蛋白的表达得到有效抑制，抑制率分别为29．1±5．82％和56．7±2．49％。因此，选择hTERT一3114构建慢病毒载体。3．成功构建了重组慢病毒载体质粒PGCL．hTERT3114一GFP。经病毒包装

6、后，得到了携带hTERT3114的成熟的重组慢病毒颗粒Lenti—hTERT3114，病毒滴度达到了4．16x108TU／ml。4．重组慢病毒Lenti—hTERT3114感染Tca8113细胞，细胞生长受到抑制，感染第8天时，抑制率为41．7％。1周后检测其hTERTmRNA及其蛋白表达，抑制率分别为72．96±1．47％和73．60+2．01％，内参B．actin表达未受影响。结论：本实验成功构建了靶向hTERT基因的重组慢病毒载体Lemi．hTERT3114，并利用该慢病毒载体成功地将hTERT3114siRNA表达框架转导入Tea811

7、3细胞，使其持续表达，实现了靶向hTERT基因的RNA干扰。重组慢病毒载体有效地抑制了Tea8113hTERTmRNA及其蛋白的表达，抑制了Tea8113细胞的生长。通过实验，初步说明慢病毒载体介导的RNAi技术对口腔鳞癌的基因治疗具有良好hTERT—shRNA慢病毒载体构建及其抑制舌鳞癌Tca8113细胞株的体外实验研究的应用前景。关键词：口腔鳞癌；RNA干扰；慢病毒载体；端粒酶；hTERT；Tca8113细胞；基因治疗VhTERT—shRNA慢病毒载体构建及其抑制舌鳞癌Tca8113细胞株的体外实验研究Experimentalresearc

8、hofhTERT-shRNAlentiviralvectorconstructionanditssuppressionofthehumantongue