抑制性消减杂交技术介绍

《抑制性消减杂交技术介绍》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、September20,2021宝日医生物技术（北京）有限公司Clontech抑制性消减杂交技术介绍主要内容2Clontech相关产品3实验流程4参考文献1抑制性消减杂交技术概述抑制性消减杂交(SSH)---DiatchenkoL,etal.PNAS1996;93:6025-6030Suppressionsubtractivehybridization:amethodforgeneratingdifferentiallyregulatedortissue-specificcDNAprobesandlibraries抑

2、制性消减杂交技术不同丰度的单链DNA得到均衡杂交动力学目的基因得到富集抑制性PCR抑制性消减杂交—原理采用两次消减杂交和两次PCR，保证了高特异性；通过杂交操作，可以获得低丰度差异表达基因；使用SMARTer™PCRcDNASynthesisKit(634925/26)合成cDNA，只需2ng总RNA；操作简便，实用有效，全过程仅需3-4天。假阳性率低、特异性高、灵敏度高、操作简便、周期短抑制性消减杂交—特点构建消减cDNA文库研究细菌毒力的相关基因研究病原体感染后的应答基因鉴定抗病毒相关基因......抑制性消减杂

3、交—应用PCR-SelectTMcDNASubtractionKit(CatNo.637401)高效富集差异表达基因PCR-SelectTMBacterialGenomeSubtractionKit(CatNo.637404)分析细菌基因组差异序列ClontechPCR-SelectTM相关产品处理组非处理组TesterDriver正向消减DriverTester反向消减抑制性消减杂交实验方法0.5～2μgpolyA+RNA0.01～1μg总RNA传统方法合成cDNASMARTerTMPCR方法合成cDNARsaI限

4、制性内切酶酶切cDNA末端接头连接两次消减杂交两次PCR扩增富集差异表达基因SMARTer™PCRcDNASynthesisKit(634925/26):从2ng总RNA中合成cDNASMARTer™PicoPCRcDNASynthesisKit(634928):从低至1ng的总RNA中合成cDNA实验流程杂交动力学抑制性PCR由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接头连接第一次消减杂交第二次消减杂交第一次PCR扩增第二次PCR扩增富集差异表达基因末端补齐实验流程TestercDNA+Adaptor1Teste

5、rcDNA+Adaptor2R由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接头连接第一次消减杂交第二次消减杂交第一次PCR扩增第二次PCR扩增富集差异表达基因末端补齐实验流程TestercDNAwithAdaptor1TestercDNAwithAdaptor2RDrivercDNA（过量）ABCDABCD由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接头连接第一次消减杂交第二次消减杂交第一次PCR扩增第二次PCR扩增富集差异表达基因末端补齐实验流程ABCDTester杂交液（Adaptor1）ABCDTester杂交

6、液（Adaptor2R）DrivercDNA（加热变性）A,B,C,DE由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接头连接第一次消减杂交第二次消减杂交第一次PCR扩增第二次PCR扩增富集差异表达基因末端补齐A,B,C,DABCDE末端补齐EE实验流程由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接头连接第一次消减杂交第二次消减杂交第一次PCR扩增第二次PCR扩增富集差异表达基因末端补齐实验流程ABCDE加入共用PCR引物A,D:不能被扩增C:线性扩增B:扩增受到抑制E5’3’3’5’EE非特异性表达基因得到极大的扣除

7、，高效地富集了差异表达基因。由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接头连接第一次消减杂交第二次消减杂交第一次PCR扩增第二次PCR扩增富集差异表达基因末端补齐实验流程E5’3’3’5’加入巢式PCR引物E由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接头连接第一次消减杂交第二次消减杂交第一次PCR扩增第二次PCR扩增富集差异表达基因末端补齐琼脂糖凝胶电泳检测，RNA有两条明显的带28S和18S，亮度在2:1左右。OD260/OD280为1.8～2.2。哺乳动物poly＋ARNA0.5～12kb，非哺乳动物0.5～

8、3kb。M小鼠肝脏总RNA28S18S5S实验过程要点分析M:Marker1:未酶切的dscDNA2:酶切后的dscDNA人类骨骼肌dscDNA如果酶切效果不好，需要重新抽提纯化cDNA，重新进行酶切。由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接头连接第一次消减杂交第二次消减杂交第一次PCR扩增第二次PCR扩增富集差异表达基因末端补齐实验过程