egcg与锌离子抑制缺氧复氧损伤诱导的大鼠心肌细胞凋亡及相关机制

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1、EGCG与锌离子抑制缺氧/复氧损伤诱导的大鼠心肌细胞凋亡及相关机制Anti-apoptoticProtectionAffordedbyEGCGandZinctoMouseCardiomyocytesSubjectedtoHypoxia/reoxygenationInjury研究生：曾欣专业：内科学导师：谭学瑞教授中国汕头2012．5汕头大学医学院博士学位论文摘要背景和目的1、细胞凋亡是心肌缺血再灌注损伤的重要特征之一，磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路的激活在心肌缺血再灌注损伤的保护

2、中起决定性的作用。2、没食子儿茶素没食子酸（EGCG）能通过激活PI3K/Akt信号通路抑制胰腺β细胞的凋亡，但EGCG在心肌缺血再灌注损伤这一病理过程对PI3K/Akt信号通路的影响有待研究。3、外源性锌能够调节参与心肌缺血再灌注损伤保护机制的某些信号通路而保护细胞2+凋亡，同时有研究显示外源性锌离子（Zn）可以增强EGCG对体外培养肝细胞的保护2+作用。EGCG与Zn的联合使用能否在心肌细胞缺血再灌注损伤中表现出更显著的保护效应值得探讨。2+因此，本实验观察不同浓度的EGCG、Zn及两者联合使用对心肌细胞

3、的活力影响，并通过H9c2心肌细胞缺氧/复氧（H/R）损伤的模型，研究上述药物对凋亡的保护作用，并初步探讨其可能存在的机制。方法H9c2心肌细胞经缺氧3小时，再灌注1小时后建立缺氧/复氧（H/R）损伤的模型。采用MTT比色法测定光密度值，观察不同浓度的EGCG（0μM、5μM、10μM、15μM、20μM）2+及Zn（0μM、5μM、10μM、15μM、20μM）对H9c2心肌细胞活力的影响，选取理想的药2+物浓度即10μM的EGCG及5μM的Zn进行以下实验。H9c2培养48h后随机分为以下实验组（n=6）

4、：①正常对照组：不行任何处理；②H/R损伤模型组：细胞仅行H/R处理；③EGCG2+组：细胞缺氧前30min加入10µMEGCG预处理，随后予10µMEGCG进行复氧孵育；④Zn2+2+组：细胞缺氧前30min加入5µMZn预处理，随后予5µMZn进行复氧孵育；⑤EGCG+2+2+Zn组：细胞缺氧前30min加入10µMEGCG及5µMZn预处理，随后予10µMEGCG及52+2+µMZn进行复氧孵育；⑥EGCG+Zn+LY294002（〔2，4-吗琳基-8-苯基-4-氢-1-苯并毗喃2+-4-酮，PI3K抑

5、制剂）组：在细胞缺氧前30min加入10µMEGCG、5µMZn及20μM2+LY294002预处理，随后予10µMEGCG、5µMZn及20μMLY294002进行复氧孵育。通过I汕头大学医学院博士学位论文2+2+Hoechst33258染色，观察分析经EGCG、Zn或EGCG+Zn处理后行H/R损伤的心肌细胞在形态学上变化，并进行凋亡指数（AI）比较；Westernblot法检测天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）及磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）蛋白的表达。实验数据采用单因素方差分析（o

6、ne-wayANOVA）,各样本均数之间的多重比较采用LSD（leastsignificantdifference）t检验进行分析。P＜0.05认为差异具有统计学意义。采用SPSS17.0统计学软件进行统计学处理。结果2+1、不同浓度的EGCG及Zn对心肌细胞生长的影响不同。EGCG浓度为5μM、10μM、2+15μM及Zn浓度为5μM时，对细胞活力无抑制作用，而且10μMEGCG还表现出促进生长作用，细胞活力与对照组比较明显增加，p＜0.05。较高浓度的EGCG（20μM）和2+Zn（≥10μM）则明显抑制

7、H9c2心肌细胞的生长，p＜0.05。同时运用10μMEGCG和5μM2+Zn，测其细胞活力与10μMEGCG组无差异。2、以Hoechst33258染色检测凋亡，H/R对照组中多数细胞呈现典型的凋亡形态学表2+现。Zn组的AI较H/R组明显降低（39.7±1.8%vs.28.1±0.8%，p<0.05），10μMEGCG+5μM2+2+Zn组比Zn组更进一步降低了AI（17.6±1.3%vs.28.1±0.8%,p<0.01），而EGCG组AI为36.3±1.8%，与H/R对照组比较无差异。2+2+3、5µ

8、MZn组一定程度上抑制了激活型caspase-3的表达。10µMEGCG+5µMZn2+2+组表达最低，与H/R组及5µMZn组比较，p<0.01，10µMEGCG+5µMZn+LY294002组的caspase-3与10µMEGCG处理组及H/R组之间的表达均无差异。2+2+4、p-Akt在5µMZn组明显增高，与H/R组比较，p<0.01。10µMEGCG+5µMZn2+2+组p-Akt表达最高