基于高通量技术的hpv相关全基因组分析及特定mirna在宫颈癌发生中的作用与机制

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1、浙江大学博士学位论文基于高通量技术的HPV相关全基因组分析及特定miRNA在宫颈癌发生中的作用与机制姓名：李阳申请学位级别：博士专业：妇产科学指导教师：谢幸20120522浙江大学博上学位论文中文摘要基于高通量技术的HPV相关全基因组分析及特定miRNA在官颈癌发生中的作用与机制浙江大学医学院博士研究生导师中文摘要妇产科学李阳谢幸宫颈癌是女性常见恶性肿瘤和癌症相关死亡原因之一，严重威胁女性健康与生命．宫颈癌也是迄今病因最为明确的肿瘤，业已确认，高危人乳头瘤病毒(HR-HPV)感染是宫颈癌发生的必要因素．大量证据表明，从HPV感染到宫颈癌的发生是一个渐进的、缓慢的过程，存在明确的癌前

2、期病变阶段，即官颈上皮内瘤变(CIN)，这为我们提供了有利的阻断时机，但目前针对CIN的治疗手段仍以毁损性手术为主，尚缺乏无创、特效的阻断方法。转化医学概念的提出为我们提供了新的研究思路，如何利用临床HPV感染和宫颈病变进展模型发现HPV感染和宫颈癌发生的核心靶标或作用通路继而用以指导临床诊断和治疗，是研究阻断宫颈癌发生新方法的核心问题．本课题将基于这一思路开展前期研究。利用生物芯片技术筛选HPV感染过程中宫颈组织miRNA表达谱，筛选可以用于HPV感染和官颈病变发生过程中早期诊断、预测和靶向治疗的miRNA标志物，是宫颈癌转化研究中的首个重点．由于miRNA各种生物学功能的发挥本

3、质上都是通过调控靶基因的表达实现的，不仅表现在表达丰度的调控，同时也包括基因结构如剪切亚型的调节，因此，miRNA组学水平的研究与转录组学的研究密不可分。第二代高通量测序技术与生物芯片技术相结合，整合miRNA组学与mRNA转录组学研究结果，结合体外3'UTR分析，将从体内全基因组水平为Ⅱl浙江大学博tz学位论文中文摘要miRNA靶体作用机制研究提供新的研究思路，为从“RNA组学”的整体水平对HPV感染和宫颈癌致癌机制的系统性研究奠定基础．同时，人体生殖道系统是一个菌群复杂的微生物环境，迄今尚不明确HPV持续感染是否与生殖道微生态失调有关，是否有其它病原体感染促进了HPV的持续感染

4、或恶性转化；而且由于HPV病毒体外分离与培养的困难性，至今对体内标本中HPV金基因组结构与功能的研究仍然有限。Phi29聚合酶介导的滚环DNA复制技术可以不依赖于微生物的培养体系而对之进行有效扩增，其产物进行深度测序后可以用于全基因组分析，有助于HPV病毒基因结构、表达方式和种属关系的深入研究，明确生殖道微环境与HPV感染的关系，并在HPV感染和宫颈癌的作用机制研究中首次引入官颈宏基因组学(metagenome)的概念。本研究将基于生物芯片和第二代测序等高通量分析技术，首先通过对miRNA组学、转录组学和以HPV为典型代表的宏基因组学水平展开多角度、全方位的整合和贯穿研究，筛选可以

5、用于HPV感染和官颈癌早期诊断及评估患者预后的分子标志物和药物靶标；随后在已完成HPV感染过程中官颈组织miRNA表达谱的筛选和一系列生物信息学分析基础上，针对特定miRNA展开功能研究。以期建立宫颈癌转化研究的理论体系和实验平台，为日后架起一座沟通实验室与临床之间的转化桥梁夯实基础。IV浙江大学博}学位论文中文摘要第一部分HPV感染和官颈癌发生过程中的全基因组研究目的通过高通量分析技术，对miRNA组学、转录组学和以HPV为典型代表的宏基因组学水平展开多角度、全方位的整合和贯穿研究，以宫颈组织中差异表达的miRNA为代表，筛选可以用于HPV感染和宫颈癌早期诊断及评估患者预后的分子

6、标志物和药物靶标，为宫颈癌的转化研究提供完整而全新的分子生物学信息，并为后续体外功能学实验研究奠定坚实的基础。方法首先利用ParaflomiRNA芯片，初步确定6例HPV阴性正常宫颈组织、7例单纯HPVl6阳性正常宫颈组织、6例单纯HPVl6阳性CIN2．3、6例单纯HPVl6阳性官颈癌组织中的不同miRNA表达特征，并通过芯片差异显著性分析(SAM)和深度分析(In．depthanalysis)，筛选宫颈癌发生过程中差异表达的miRNA，然后对其进行生物功能学分析(Geneontology,GO)，并利用miRNA靶体数据库和GENE数据库，筛选与HPV感染相关的miRNA靶基因

7、，构建"HPV感染相关的miRNA／靶体基因”网络图。通过Real-timePCR对6个miRNA(miR-29a’}，miR-375、}，miR．195上，miR-99a工，miR-155T，miR-92aT)在133例宫颈组织中进行表达检测，验证miRNA芯片数据的准确性，并明确这6个miRNA在正常宫颈组织、HPV感染CIN2．3和宫颈癌中的表达特征．其次，通过方向特异性RNA测序(DirectionalLigationsequencing，DeLi—sect)