基于克隆异质性分离和鉴定人胃癌干细胞

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1、江苏大学硕士学位论文基于克隆异质性分离和鉴定人胃癌干细胞姓名：杨宏琼申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：张尤历20120607江苏大学硕士学位论文摘要肿瘤的发生是多种因素共同作用的结果，侵袭和转移是恶性肿瘤的显著特征，但并非所有的肿瘤细胞都具有无限增殖和转移的能力。肿瘤干细胞(cancerstemcells，CSCs)N论认为CSCs是肿瘤中少数具有自我更新能力和分化潜能，并能产生耐药的细胞亚群，是肿瘤发生、复发和转移的根源。研究报道，在体外培养条件下，多种肿瘤细胞克隆具有形态异质性，可形成三种不同形态的克隆，分别称为Holoclone

2、，Meroclone和Paraclone。三种克隆具有明显不同的增殖能力，其中Holoclone克隆形态规则、细胞体积小且排列紧密，成瘤能力强，具有肿瘤干细胞的特性，而其它两种类型克隆则不具备成瘤能力。已有多个研究表明胃癌中存在肿瘤干细胞，但目前仍缺乏直接证据。在胃癌中是否也存在克隆形态异质性，这种异质性是否可以用于胃癌干细胞的识别和分选，以及探索一种有效的富集胃癌干细胞的方法成为我们试图解决的问题。本研究以人胃癌细胞株SGC．7901和BGC．823为模型，动态观察了胃癌细胞株SGC．7901和BGC．823的克隆在形态上的异质性并进行了

3、分类，检测了CD44，Musashi．1和CDX2在不同类型克隆中的表达，比较不同克隆细胞在裸鼠体内的成瘤能力，初步鉴定含肿瘤干细胞的克隆。本研究共分为以下三个部分：第一部分，动态观察SGC．7901和BGC．823细胞的克隆在形态上的差异并分类，检测不同克隆细胞的自我更新能力。结果发现SGC．7901和BGC．823细胞均可形成Holoclone，Meroclone和Paraclone三种形态克隆。SGC．7901细胞克隆形成率为9．80+1．07％，三种克隆的比例分别为10．2％、56．O％和33．8％；BGC．823细胞克隆形成率为基

4、于克隆异质性分离和鉴定人胃癌干细胞8．404-1．02％，三种克隆的比例分别为9．8％、54．O％和36．2％。再次克隆形成实验结果显示，来自Holoelone克隆的细胞不仅形成了与原有克隆类似的Holoclone克隆，还可形成Merodone及Paraclone克隆，表明Holoclone来源的细胞具有自我更新能力。第二部分，观测了SGC．7901和BGC．823细胞克隆的分化异质性。本部分利用免疫荧光技术和免疫印迹法(Westernblotting)检测了SGC．7901和BGC．823细胞克隆中两种干细胞标志物CD44，Musashi

5、．1和分化标志物CDX2的表达情况。免疫荧光结果表明以上两种细胞克隆中Holoelone克隆CD44，Musashi．1的表达最强，CDX2表达最弱；Paraclone克隆CDX2表达最强，CD44，Musashi．1表达最弱；Meroclone克隆上述三种标志物均有一定程度的表达，表达量居于Holoclone和Paraclone克隆之间。由于所提蛋白量不足，Westernblotting仅观测了CD44和CDX2的表达情况，其结果与免疫荧光一致。第三部分，分离SGC．7901和BGC．823细胞不同形态克隆，观察了不同形态克隆细胞在裸鼠体

6、内的成瘤能力。本部分利用克隆环收集了三种形态的克隆细胞，将不同克隆形态细胞接种于裸鼠皮下，观察各组的成瘤能力。结果显示，Holoclone克隆细胞具有较强的致瘤能力，而Meroclone和Paraclone克隆不具备致瘤能力。以上研究结果表明，SGC．7901和BGC．823细胞形成的克隆在形态和分化程度上具有异质性。来自Holoclone克隆的细胞具有自我更新、多向分化等肿瘤干细胞的特性，在活体内有较强的成瘤能力，Holoclone克隆富含胃癌干细胞。综上所述，利用细胞克隆的异质性可以分离鉴定胃癌干细胞，为获得胃癌干细胞提供了一种新的简便

7、易行的方法。关键词：肿瘤异质性，肿瘤干细胞，细胞克隆，胃癌Ⅱ江苏大学硕士学位论文ABSTRACTThereasonoftumorigenesisisduetovariousfactors，invasionandmetastasisareprominentfeaturesofmalignanttumors，butnotalltumorcellshavethecapacitiesofinfiniteproliferationandmetastasis．Theoriesofcancerstemcells(cscs)considerthatCSCs

8、areaminorityofcellswhichowntheabilityofself-renewanddifferentiation．CSCsareasubpopulation