三甲氧基苯甲醛环丙沙星席夫碱诱导人肝癌细胞凋亡作用的研究

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1、摘要目的通过筛查12种喹诺酮衍生物，选择一种对人肝癌SMMC-7721细胞增殖有显著抑制作用的化合物，并研究其诱导细胞凋亡机制，为该类化合物的开发利用提供理论依据。方法MTT法初步筛选对人肝癌SMMC-7721细胞有显著增殖抑制作用的化合物，计算细胞生长抑制率及IC50值（半数抑制率）。选择对肝癌细胞增殖抑制作用最为显著的化合物M27，检测其对人结肠癌HCT-116细胞株、白血病JURKET细胞株的增殖抑制作用，以及M27前体化合物环丙沙星盐酸盐对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用，并且绘制随药物浓度变化的细胞增殖抑制曲线；Hoechst33258染色，荧光显微镜下观察凋亡细胞形态学变

2、化；TUNEL法检测细胞凋亡率；高内涵活细胞成像系统检测细胞线粒体膜电位（△ψm）的变化；Western-blotting检测p53、Caspase-9、Caspase-3、Caspase-8、Bcl-2和Bax等凋亡相关蛋白表达的变化，以及细胞色素C在线粒体内外分布的变化。结果12种化合物具有不同程度的增殖抑制作用，其中M25、M26、M27、M28、M32、-1-1M36六种化合物在20μmol∙L~60μmol∙L药物浓度作用下，显示出较强的细胞增殖抑制活性；三甲氧基苯甲醛环丙沙星席夫碱衍生物，1-环丙基-6-氟-7（-4-H-哌嗪-1-基）-3-[S-（3,4,5-3-甲氧基苄基

3、硫基）-4-（3,4,5-三甲氧苯甲叉基氨基）-1,2,4-均三氮-3-基]-喹-1-1啉（1-H）-4-酮(M27)活性最强，在10μmol·L~60μmol·L的浓度范围内能显著抑制肝癌细胞增殖并呈浓度、时间依赖关系，作用于肝癌SMMC-7721细胞24h、48h、72h的-1-1-1IC50值分别是39.97μmol·L，26.67μmol·L，23.04μmol·L；M27对HCT-116结肠癌细胞以及白血病JURKET细胞均有显著地增殖抑制作用，呈时间-剂量依赖关系。M27作-1-1用HCT-116结肠癌细胞株24h、48h、72h的IC50值分别为46.07μmol·L，39

4、.57μmol·L-1和17.48μmol·L。白血病JURKET细胞经M27作用24h、48h、72h的IC50值分别为-1-1-144.33μmol·L，30.89μmol·L和21.91μmol·L。M27的前体化合物环丙沙星盐酸盐对SMMC-7721肝癌细胞株增殖抑制作用不显著，24h、48h、72h的IC50值分别为180.23-1-1-1-1μmol·L，152.34μmol·L和140.90μmol·L。不同浓度的M27（0,21.68,37.97,47.73μmol·L）I作用于SMMC-7721细胞24h，Hoechst33258荧光染色观察细胞形态学变化。检测结果显示

5、，对照组细胞核呈弥散均匀荧光；M27处理组可见凋亡细胞数明显增多，具有浓度依赖性并呈正相关。表现为细胞核固缩呈致密浓染，细胞核边缘化或串珠型核、染色质凝集成颗粒状，细胞核碎裂成碎块状，晚期凋亡细胞可见凋亡小体等典型凋亡特征性改变。TUNEL实验结果显示凋亡细胞比率逐渐增多，与M27作用浓度的增加呈剂量依赖性，且药物处理组细胞凋亡率显著高于对照组（P<0.05）；M27处理组细胞线粒体膜电位（△ψm）降低，与对照组相比分别降低（11.12±8.80）%，（46.52±18.74）%，（63.05±22.84）%，具有显著地统计学差异（P<0.05）。Western-blotting检测结果

6、显示p53、Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3蛋白量表达较对照组升高，Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3活性裂解片段亦显著增多，呈明显的浓度依赖关系；Bcl-2家族中促凋亡蛋白Bax的表达量增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量降低；线粒体细胞色素c分布减少，胞浆细胞色素c分布增多。结论1.M27具有抑制肝癌SMMC-7721细胞增殖作用，其抑制作用效果呈浓度和时间依赖性。2.M27有诱导SMMC-7721细胞凋亡的作用。3.M27诱导细胞凋亡作用可能通过线粒体凋亡通路完成，但不能排除膜死亡受体通路。关键词：3-甲氧基苯甲醛环丙沙星席夫碱，肝

7、癌细胞，凋亡，线粒体膜电位IIABSTRACTObjectiveToscreened12novelantibacterialfluoroquinolonederivative,selectacompoundswhichhavehighinhibitingactivitytoproliferationagainsthumanhepatocarcinomaSMMC-7721cells,hroughtheidentificationoft