pires-ag85a-esat6抗结核二价dna疫苗的构建及其免疫效应研究

《pires-ag85a-esat6抗结核二价dna疫苗的构建及其免疫效应研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、万方数据中图分类号：B3窆2学科分类号：巡论文编号：——密级：公珏安徽理工大学硕士学位论文pIRES—A985A．ESAT6抗结核二价DNA疫苗的构建及其免疫效应研究作者姓名：强置专业名称：鱼疫堂研究方向：盆王鱼瘗堂导师姓名：迕垫筮副教援导师单位：医堂院答辩委员会主席：基趔旺教援论文答辩日期：2014年5月30日安徽理工大学研究生处2014年6月6日万方数据ConstructionofantituberculosisdivalentDNAvaccineofplRES--A985A--ESAT6anditsimmun

2、ologicaleffectCandidate：ZhangLeiSupervisor：XuLifaMedicalSchoolAnHuiUniversityofScienceandTechnologyNo．168，ShungengRoad，Huainan，232001，P．R．CHINA万方数据独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方以外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塞徵堡王太堂或其他教育机构的学位或

3、证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：毖!鍪日期：础年』月』日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解塞邀堡王太堂有保留、使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属于塞邀堡三太堂。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权安徽理工大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密

4、后适用本授权书)学位论文作者签名：张‘考签字日期：加f睁／月∥日万方数据摘要目的通过以plRES质粒为载体构建可同时独立表达A985A和ESAT6两种抗原的抗结核二价DNA疫苗，并经体外实验评价其免疫原性及免疫效应，为新型结核疫苗的研发提供新的思路和实验基础。方法1．根据GenBank报道的目的基因(A985A和ESAT6基因)全长序列和plRES质粒酶切位点的特点，利用DNAClub及PremierPrimer5软件设计特异性引物。以结核杆菌标准株H37Rv的DNA为模版，经PCR扩增A995A和ESAT6基因，

5、分别用限制性内切酶NheI、EcoRI和SalI、EagI对扩增产物和plRES空质粒双酶切，经连接酶连接，构建plRES—A985A—ESAT6重组质粒，并经菌液PCR、质粒双酶切和质粒测序鉴定。2．plRES—A985A．ESAT6重组质粒鉴定构建成功后，转入DH5a菌株，筛选重组质粒，并用质粒小提试剂盒分离纯化质粒DNA。3．将重组质粒采用脂质体法转染至RAW264．7细胞，于5％C02培养箱中，37℃，培养24--一48h后，westernblot法检测质粒蛋白表达情况。4．大量提取重组质粒，经三次肌肉注射

6、质粒免疫BALB／c小鼠，每次间隔2w，末次免疫2w后，取小鼠血清，用ELISA法检测血清中抗A985A抗体和抗ESAT6抗体情况。5．同时无菌取小鼠脾细胞在A985A和ESAT6蛋白刺激下培养，用ELISA法检测培养液中细胞因子(IFN吖、IL一2、IL-4)分泌情况。结果1．成功构建plRES—A985A—ESAT6重组质粒，经PCR鉴定、质粒双酶切，DNA凝胶电泳后，分别出现1017bp和288bp的条带，与A985A和ESAT6的理论值相符，并经测序进一步鉴定构建成功。2．分别将用三种浓度的plRES．A9

7、85A．ESAT6重组质粒转染至RAW264．7细胞后，经westernblot鉴定证实了A985A和ESAT6两种蛋白可在细胞内成功表达，且表达水平与转染剂量存在正相关。3．ELISA法检测免疫小鼠血清中抗A985A抗体和抗ESAT6抗体变化情况，发现转染了plRES—A985A—ESAT6质粒的二价疫苗组，相应的抗A985A抗体和抗万方数据摘要ESAT6抗体明显升高，(尸<0．05)，且IgG2a抗体升高明显。4．在细胞因子检测中，plRES—A995A—ESAT6质粒组的IFN-1,、IL一2水平显著升高(尸

8、<0．05)，而IL．4的值均较低，组间无显著差异性。结论1．plRES—A985A—ESAT6DNA疫苗，能够在真核细胞中独立表达A985A和ESAT6两种抗原。2．plRES．A985A．ESAT6DNA疫苗可诱导小鼠强烈的特异性免疫应答，且以Thl优势免疫应答为主。3．plRES．A985A．ESAT6DNA疫苗较单一A985A或ESAT6疫苗特异性免