mir-142-5p高表达及抑制小鼠骨折模型建立及表型分析

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1、万方数据中图分类号：UDCR58610博士学位论文学校代码避密级盟MiR-142-5p高表达及抑制小鼠骨折模型建立及表型分析TheestablishmentofmiR-142--5poverexpressionandinhibiti。modelsandanab"ofbonefracturemhibonmicemorielsandanalystsOIDOneIracphenotypes作者姓名：程鹏学科专业：内科学研究方向：内分泌与代谢病学院(系、所)：湘雅二医院指导教师：罗湘杭教授论文答辩日期．丝!鳖

2、埤一答辩委员会中南大学二O一四年五月万方数据原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：翟■日期：旦年生月if_El学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规

3、定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：吐导师签名纽鱼日期：旦年兰月旦日万方数据博士学位论文中文摘要第一部分MiR-142．5p高表达或抑制转基因小鼠模型的建立目的：建立miR-142—5p在骨组织内特异性高表达及抑制的转基因小鼠模型，以进一步分析miR-142．5p在小鼠体内对骨折愈合的影响。方法：(

4、1)、首先合成pre—miR-142和miR-142．5psponge序列，序列两端包含SalI和EcoRI酶切位点，插入到本实验室保存的含骨钙素启动子的表达质粒(pOG2．Cre．hGH)中，替换原质粒的Cre序列。构建好的质粒分别命名为Bglap—pre-miR-142和Bglap．miR-142．S，经测序及酶切后电泳验证；(2)在MC3T3．E1前成骨细胞株中分别转染Bglap-pre—miR-142和Bglap—miR-142．S质粒，使用含抗坏血酸及B．甘油磷酸钠的培养液诱导成骨分化72h

5、，使用PCR法检测细胞内miR-142-5p表达水平变化；(3)将Bglap．pre．miR-142和Bglap—miR-142一S表达质粒通过显微注射的方法注射到C57BL／6小鼠的受精卵原核内，待小鼠出生后3周使用PCR法鉴定表达质粒己整合到小鼠基因组中；(4)使用PCR法检测miR-142．5p和miR．142．5psponge转基因小鼠不同组织内的miR-142—5p表达，验证两种小鼠是否存在骨组织特异性的miR-142．5p表达增加或降低。万方数据搏士学位论文中文摘要结果：1、成功构建了含骨

6、钙素启动子的pre—miR-142—5p和miR-142-5psponge表达质粒，其能在MC3T3．E1细胞向成骨细胞分化过程中表达，并导致细胞内miR-142-5p增加或降低；2、成功构建了骨组织特异性表达的pre—miR-142-5p和miR-142．5psponge转基因小鼠，可导致骨组织特异性miR-142-5p表达增加或降低。结论：成功构建了骨组织特异性miR-142．5p高表达或抑制的转基因小鼠模型，为下一步体内研究miR-142-5p在骨折愈合过程中的作用奠定了基础。关键词：micro

7、RNA；转基因；骨特异性II万方数据博士学位论文中文摘要第二部分M诹．142．5p高表达或抑制转基因小鼠模型的骨折表型分析目的：研究体内骨组织特异性miR一142—5p高表达或抑制对骨折愈合的影响，探讨miR一142-5p在骨折愈合中的作用机制。方法：(1)、使用单侧开放性股骨干横形骨切开术并锁钉内固定法，在野生型、miR-142．5p骨组织特异性高表达型以及miR-142—5p骨组织特异性抑制型转基因小鼠中构建骨折模型；(2)、使用X线摄片、组织切片HE染色检测转基因小鼠骨折后7d、14d、21d的

8、骨折愈合情况，观察miR-142．5p高表达或抑制对骨折愈合的影响；(3)、使用qRT-PCR法检测转基因小鼠骨折后Od、7d、14d、21d、28d的miR-142—5p及骨钙素表达水平，观察其表达模式；(4)、使用qRT-PCR及WesternBlot法检测转基因小鼠骨折部位WWPl的表达，在体内验证WWPl为miR-142—5p的靶基因。结果：1、成功在野生型、miR-142—5p骨组织特异性高表达型及抑制型转基因小鼠中构建骨折模型。2、X线摄片显