bnip3在镉神经毒性中的作用及分子机制研究

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1、南方医科大学2011级硕士学位论文BNIP3在镉神经毒性中的作用及分子机制研究MolecularmechanismofBNIP3inCadmium—inducedneurotoxicity课题来源：国家自然科学资金：81101611国家自然科学资金：81272180国家重点基础研究发展计划(973计划)分题2012CB518200专业名称劳动卫生与环境卫生学学位申请人萧嘉丽指导教师邹飞教授答辩委员会主席答辩委员会成员论文评阅人余El安教授董军教授陈雪梅教授蔡春青教授李文军副教授董军教授孟晓静教授2014年5月20号广州硕士学位论文

2、BNIP3在镉神经毒性中的作用及分子机制研究硕士研究生：萧嘉丽指导教授：邹飞教授摘要背景镉(Cadmium，Cd)是一种高度毒性的重金属，主要来源于冶炼、石油燃烧、工业废物、金属澄清剂以及香烟等。除职业工人外，普通居民因污染的水、空气和土壤而日益成为潜在的接触人群。Cd能引起癌症、肾和生殖功能障碍，以及神经功能紊乱。Cd暴露可引起儿童的学习障碍。成人Cd作业者可表现出神经性缺陷如心理反应速度减慢：同时工人主诉平衡能力下降和注意力减退。Cd诱导的神经毒性包括细胞死亡、神经生物化学改变(神经递质和受体)和生理／行为的改变。Cd可造成两

3、种形式的细胞死亡：caspase依赖的凋亡和caspase不依赖的坏死样死亡。文献报道，Cd能诱导神经细胞同时发生凋亡及坏死样死亡。Cd通过复杂的信号通路诱导神经细胞死亡，包括：氧化应激，MAPKs(Mitogen—activatedproteinkinases)和mTOR的激活。然而在Cd诱导的神经细胞死亡中，凋亡及坏死样死亡的作用仍不清楚。此外，Cd诱导的坏死样死亡的分子机制仍然未知。BNIP3蛋白(Bcl一2andadenovirusE1B一19kDa—interactingprotein3)，是Bcl一2蛋白家族中BH3-

4、only亚家族的一员，在细胞死亡中发挥重要作用。BNIP3广泛涉及多个病理过程，例如心肌肥大和萎缩、肿瘤形成和神经系统缺氧／缺血。最新的研究发现BNIP3与神经退行性疾病亨廷顿氏病(Huntington’S摘要Disease，HD)密切相关，在HD病人的肌肉细胞及HD动物模型的脑组织中均检出BNIP3的异常积聚。当前，越来越多的研究结果表明BNIP3参与caspase不依赖的细胞死亡。此外，有研究显示某些毒素如氰化物和钴(Cobalt，Co)能诱导细胞表达BNIP3，且BNIP3参与这些毒素诱导的细胞死亡。然而，Cd诱导的神经毒性

5、中BNIP3是否发挥同样的作用未见报道。MAPKs是Cd诱导神经毒性中的重要分子。MAPKs由丝氨酸一苏氨酸激酶级联放大信号组成。哺乳类动物的MAPKs家族包括细胞外信号调节激酶(ERK)，p38和c—JunNH2端激酶(JNK)。很多研究表明MAPKs参与神经炎症反应和神经变性过程。尽管MAPKs对Cd诱导的神经毒性有着重要作用，但其下游分子仍然未知。目的本研究通过联合使用多种细胞生物学和分子生物学实验方法，如RNA干扰、qRT—PCR、蛋白免疫印迹、台盼蓝排斥法和PI染色等，探讨BNIP3在cd诱导神经毒性中的作用和分子机制。

6、方法L我们选择SH-SY5Y和PCI2细胞为研究对象。采用台盼蓝排斥法检测不同Cd浓度条件下神经细胞的死亡率。2．cd处理细胞不同时间点后使用免疫印迹法检测caspase-3和PARP蛋白的表达。预先使用pan—caspase抑制剂(zVAD-fmk)或两个坏死抑制剂(Necrox一2和Necrox一5)处理神经细胞，然后加入Cd处理神经细胞12h。通过台盼蓝染色及检测培养基中乳酸脱氢酶(LDH)含量，计算各组死亡率。3．分别使用qRT—PCR和免疫印迹，检测Cd处理的神经细胞BNIP3基因和蛋白的表达。4．通过瞬时转染化学合成的

7、siRNA，下调BNIP3表达。RNAi下调BNIP3表达后，II硕士学位论文Cd处理神经细胞24h。通过台盼蓝排斥法检测Cd诱导的细胞死亡率；通过共聚焦显微镜检测并计算PI阳性细胞数；检测培养基中LDH含量。5．分别使用Cd或Co处理神经细胞，通过免疫印迹检测HIF一1Q蛋白的表达，通过qRT—PCR检测血管内皮生成因子(Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)基因的表达。6．使用免疫印迹检测cd处理细胞不同时间的MAPKs激活情况。7．预先使用MEK(ERK的上游激酶)抑制剂U0126、JNK

8、抑制剂SP600125或p38抑制剂SB203580处理细胞30分钟，然后加入Cd处理神经细胞24h。使用免疫印迹检测BNIP3蛋白的表达及caspase一3的活化，通过台盼蓝排斥法检测细胞死亡率。8．构建小鼠Cd染毒模型。将20只雄性BALB／c