狂犬病病毒l蛋白聚合酶活性部位的原核表达与纯化及多克隆抗体的制备

《狂犬病病毒l蛋白聚合酶活性部位的原核表达与纯化及多克隆抗体的制备》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、广西大学硕士学位论文狂犬病病毒L蛋白聚合酶活性部位的原核表达与纯化及多克隆抗体的制备姓名：章民申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：罗廷荣20120628狂犬病病毒L蛋白聚合酶活性部位的原核表达与纯化及多克隆抗体的制备摘要狂犬病是一种人畜共患传染病，死亡率极高，一旦发病100％死亡，对人民的生命安全造成了严重的威胁。狂犬病病毒是一种单链的不分节段的负股RNA病毒，共编码5种结构蛋白，其中L蛋白为狂犬病病毒中最大的一个结构蛋白，负责病毒基因组的复制、转录以及翻译后的加工。L蛋白是高度保守的蛋白，突变会严重影响它的转

2、录和复制过程。因此，对L蛋白结构和功能的研究探索显得尤为重要。本文通过RT-PCR方法扩增了L蛋白的聚合酶活性部位基因片段，并将其克隆至pMDl8．T载体中，再亚克隆进原核表达载体pET-32a(+)上，构建重组原核表达质粒pET-L。转入大肠杆菌Rosetta(DE3)中用IPTG进行诱导表达，利用融合的His标签，通过Westernblot方法对表达产物进行检测，证实为L重组融合蛋白。通过SDS．PAGE分析，表明L蛋白以包涵体形式进行表达，通过5Mol尿素洗涤得到纯度较高的重组蛋白，用逐步透析法进行蛋白质重折叠。

3、将纯化复性后的重组蛋白与弗氏完全佐剂乳化，免疫小鼠制备抗L蛋白的多克隆抗体血清。经过稀释，l：8000的多克隆抗体仍可跟重组表达的L蛋白发生良好的反应，表明该多克隆抗体具有良好的反应性与特异性。关键字：狂犬病病毒L蛋白原核表达蛋白纯化多克隆抗体PROKARYOTICEXPI通SSIONANDPURIFICATIONOFLPROTEINPOI，YNmRASEACTIVITYMODULEINRABVANDPREPAREDTHEPOLYCLONALANTIBODYABSTRACTRabiesisanacutezoonotic

4、infectiousdiseasewithahighmortalityrate，almost100％dead，bringingahorriblethreattopeopleSlife．Rabiesvirushasasinglenon．segmentednegativestrandRNAgenome，codingfivestructuralproteins，includingthebiggestLprotein．TheLproteinisresponsibleforvirusgenomereplication，trans

5、criptionandpost-translationalprocessing·Lprotein1S一■一’ahiglllyconservativeproteinanditsmutationcouldseriouslyaffecttheprocessoftranscriptionandreplication．Therefore，studyingthestructureandfunctionofLproteinSparticularlyimportant．InthisstubtheLproteinpolymerasege

6、newasamplifiedbyRT-PCRandclonedintopMDl8．Tvector,andthensubsequentclonedintopET-32atoreconstructedanexpressionvectorpET-L．ThepET-LplasmidwastransformedintoRosetta(DE3)，andfromwhichtheLproteinwasinducedtoexpressbyIPTGUsingWesternblot．theLproteinexpressionwithfuse

7、dHis—taglabelwasdetected111eexpressionoffusionproteininE．coliwasdetectedasaformofinclusionbodybySDS．PAGE．TherecombinantLproteinwaswashedin5Molureaforpurificationandthenrefoldedbygraduallydialysismethod．111epolyclonalantibodywasacquiredbyusingpurifiedrecombinantL

8、proteinasantigentoimmunizemice．Theanti．Lpolyclonalantibodyandanti-HisantibodyspecificallyresponsedtorecombinantLproteinbyWesternblottest．After1：8000dilutionthepolyclo