器官靶向转移人肝癌单克隆细胞株的建立及其鉴定

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1、论文题目器官靶向转移人肝癌单克隆细胞株的建立及其鉴定Theestablishmentandidentificationofmonoclonalcelllineofhumanhepatocellularcarcinomawithorgansite-specifictropism指导教师：吴伟忠教授导师组成员：孙惠川教授王鲁教授本课题由国家自然科学基金项目（81071904)和上海市科委项目（11140902501)联合资助目录中文摘要1英文摘要3.、t*_i—广HiJm6第一部分肺和淋巴结靶向转移人肝癌细胞株的建立和鉴定材料与方法9雜13職17第二部

2、分肺和淋巴结靶向转移人肝癌单克隆细胞株的建立和鉴定材料与方法18结果22舰25第三部分肝癌肺和淋巴结靶向转移的分子机制研宄材料与方法2839itrt48参考文献51全文总结55仓衞点、55不足与后续研宄55文献综述57附录65聽68论文声明70复旦大学硕士学位论文中文摘要背景与目的：复发与转移是影响肝癌预后的重要因素，是制约肝癌患者长期疗效的瓶颈问题。近40年的研宄表明：小肝癌的5年生存率未有明显提高，导致肝癌患者死亡的主要原因为肿瘤的复发与转移，而器官倾向性（organsite-specifictropism)又是肝癌转移中的难解之迷

3、。作为我国高发的恶性肿瘤之一，获得具有肺和淋巴结靶向转移潜能的单克隆人肝癌细胞株，并建立相应的裸鼠靶向转移模型，不仅有利于肝癌器官靶向转移分子和治疗靶点的发掘，而且有利于靶向转移的分子机理阐明。本研究在前期课题的基础上，用极限稀释的方法进一步在体外克隆获得具有肺及淋巴结转移倾向的单克隆肝癌细胞株，并用裸鼠移植模型验证了各克隆细胞株的转移能力和器官靶向性。通过高通量测序技术鉴定其中关键差异表达基因，以期进一步理解肝癌转移尤其是器官特异性转移的分子机制，为肝癌的个体化治疗提供线索。方法：在我们研宄小组建立的荧光高转移肝癌细胞株HCCLM3-R和相应裸鼠移植模型的基础上

4、，用荧光显微镜在体定位并采集裸鼠肺和腹腔淋巴结转移灶组织，采用体内和体外交替培养和筛选方法，进一步克隆具有肺和淋巴结转移亲嗜性的人肝癌细胞株,并建立相应的裸鼠移植模型。将获得的肺和淋巴结转移亲嗜性的细胞株分别命名为HCCLM3-R-LM1和HCCLM3-R-LnMl。以HCCLM3-R-LM1和HCCLM3-R-LnMl为母细胞，用极限稀释法体外分离培养单克隆细胞。用CCK-8法检测各克隆细胞的增殖能力。用肝脏原位移植瘤模型验证各克隆细胞株的肺及腹腔淋巴结转移能力。比较HE染色病理切片中的肺转移数与荧光转移灶的符合程度。选取30条文献报道的器官靶向转移相关基因，用

5、real-timePCR和WesternBlot验证它们的表达与肝癌肺和淋巴结转移的相互关系。用裸鼠原位移植瘤病理标本对其中的差异蛋白进行免疫组化染色验证。用RNAIlluminaHiSeq?2000测序技术分析肺、淋巴结靶向高转移肝癌细胞和母细胞mRNA的表达谱，挖掘其中的差异表达基因，进行功能分类和信号通路富集分析。结果：1.以RFP稳定表达的人肝癌细胞HCCLM3-R为母细胞，采用“肝癌原位接种-取肺及淋巴结转移灶组织-体外细胞克隆和扩增-原位接种-肺或淋巴结靶向转移”的方法，经2轮筛选获得了肺和淋巴结靶向转移人肝癌细胞株HCCLM3-R-LM1及HCCLM

6、3-R_LnMl。2.对HCCLM3-R-LM1及HCCLM3-R_LnMl进行极限稀释和铺板培养。第2天在荧光显微镜下挑选和标记单细胞孔号并观察细胞的RFP表达强度。第15天单个肿瘤细胞形成细胞集落。在总共155个单细胞孔中复旦大学硕士学位论文成功培养出13株单克隆细胞株。这些细胞生长良好，能稳定传代，均高表达红色荧光蛋白。3.CCK-8检测发现各克隆细胞株的增殖能力存在明显的差异（厂〈0.01)。4.将13株肝癌克隆细胞接种裸鼠皮下后3周，8株克隆细胞成功形成皮下瘤。5.将上述皮下瘤平行移植至8只裸鼠肝脏后6周，6株克隆细胞发生远处脏器转移，但它们的肺和腹腔淋

7、巴结转移率存在显著的差异。其中LM1-S3，LM1-S4,LM1-S5和LnMl-Sll的肺转移发生率为100%,而LnMl-Sll淋巴结转移发生率为100%。LM1-S4移植瘤的肺转移灶荧光面积明显高于其他各组(p〈0.001)，但不发生淋巴结转移。LnMl-Sll移植瘤的淋巴结转移灶数目明显高于其他各组，差异有统计学意义（/K0.001),且此克隆细胞株表现出肺和腹腔淋巴结的双重器官亲嗜性。6.肺组织病理学检测发现，上述6个单克隆细胞株移植瘤的镜下肺转移灶中位数分别为102、1426、70、621、564和477个/裸鼠，差异有显著性（p〈0.001)，与体视

8、荧光显微镜