稳定分泌抗猪细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及初步应用

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1、河南农业大学硕士学位论文稳定分泌抗猪细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及初步应用姓名：李昆明申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：王新卫；王川庆201206河南农业大学2012届硕士学位论文摘要本研究将镍离子金属螯合亲和层析法纯化的猪细小病毒VP2蛋白加入等体积的弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂，分别制成完全佐剂抗原和不完全佐剂抗原，免疫6．8周龄BALB／c雌鼠，五免过后，ELISA效价达N1：51200以上的小鼠腹腔超强免疫一次，三天后取小鼠的脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞进行细胞融合。用蔗糖包埋、差速离心法制备的猪细小病毒全病毒作为包被抗原建立间接EL

2、ISA方法进行筛选，筛选抗猪细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株。采用有限稀释法，经过5．6次克隆，最终获得4株稳定分泌抗猪细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株，分别命名为：2C5、485、1A1l、5C6。经测定485和2C5仅与全病毒发生反应，1A11矛115C6为针对VP2蛋白的单克隆抗体，亚类鉴定结果显示，485是IgGl亚类，2C5是IgM贬类。对杂交瘤细胞进行染色体分析，试验结果所得平均染色体数目在92～108之间，符合SP2／0细胞的染色体数目与正常小鼠脾细胞的染色体数目之和，表明所获的抗体分泌细胞为杂交瘤细胞。对4株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体的特异性检测，

3、结果显示其仅与灭活的猪细小病毒抗原发生反应，呈阳性，而不与猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪2型圆环病毒(PCV2)抗原反应。经测定，所得4株抗猪细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞培养上清ELISA效价为l：800．1：8000，小鼠腹水单克隆抗体ELISA效价为1：8000．1：1024000。稳定性实验表明，经过连续传代10代、25代和两次冻存复苏后，杂交瘤细胞分泌抗体的能力基本不变，仍能稳定分泌特异性抗体，说明所获得的杂交瘤细胞株分泌抗体的能力稳定。利用所建立的单克隆抗体细胞株，建立了一种检测猪细小病毒抗原的免疫捕获PCR方法，该

4、检测方法具有较好的特异性和敏感性。用该方法对临床采集的13份病料进行检测，其阳性率高于常规PCR。关键词：猪细小病毒；杂交瘤细胞：单克隆抗体；间接ELISA；抗原捕获PCR第1页共66页河南农业大学2012届硕士学位论文DEVELOPMENTTOHYBRIDoMLACELLSTRAINSSECRETINGMONOCLONALANTmoDIESAGAINSTPORCINEn删oⅥRUSANDITSAPPLICA，rIoNSupervisor：WangXinweiWangChuanqingMasterCandidate：LiKunmingABSTRACT：Inth

5、isstudy,wepurifyporcineparvovirusvp2proteinwiththenickelionmetalchelatingaffinitychromatography,thenaddinganequalvolumeofFreund’ScompleteadjuvantorFreund’Scompleteadjuvant，madecompleteadjuvant，antigenandincompleteadjuvantantigen，immunizationsixtoeight·week·oldfemaleBALB／cmice，afterb

6、eingimmunizedfivetimes，themice谢tlltheELISAtiterofmorethan1：51200wereimmunizedintraveinallyforthefinalimmunization．Threedayslater，spleencellsfromimmunizedmicewerefusedwithSP2／0myelomacells．TheindirectELISAmethodwereestablishedwimsucroseembeddinganddifferentialcentrifugationasdetectio

7、nantigens．．fourcelllinesweredevelopedandidentifiedwithlimiteddilutionmethodafterfivetosixcloning，named2C5，485，1A11and5C6．Afterdetermining，485and2C5onlyresponsewithvirus，1A1and5C6responsewithvirusandVP2．Aftertheclassidentification，mAbsfrom485wereofIgG1isotype，mAbsfrom2C5wereofIgMisot

8、ype．Chromosomeanaly