广州管圆线虫感染宿主酸脑形成及调控机制的研究

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1、温州医学院硕士学位论文广州管圆线虫感染宿主“酸脑”形成及调控机制的研究姓名：张二朋申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：潘长旺；梁韶辉；黄慧聪2012-05-22温州医学院硕士学位论文广州管圆线虫感染宿主“酸脑”形成及调控机制的研究中文摘要目的1．建立感染广州管圆线虫的ICOSL√一小鼠(CD275敲基因鼠)和C57BL／6小鼠模型，观察其脾脏CD4+T淋巴细胞上协同刺激因子表达的动态变化，结合不同感染时期脑组织的病理分析结果，探索与疾病发生发展可能相关的免疫学机制。2．收集不同感染时期小鼠的脾淋巴细

2、胞，并诱导其细胞因子的表达，观察小鼠血清中IgG、IgGl、IgG2a的动态变化，分析ICOS及其配体对Thl／Th2极化的影响，探索广州管圆线虫病的分子机制及宿主的相关调控作用。方法1．构建广州管圆线虫III期幼虫感染的ICOSL√一小鼠CD275敲基因鼠和C57BL／6小鼠模型。2．分离不同感染时期小鼠脾CD4+T淋巴细胞2．1观察不同病期细胞表面协同刺激信号。流式细胞仪测定细胞的荧光，表达的阳性比例用EXP30ADC软件进行分析，其结果用SPSSl7．0采用广义线性模型的单变量分析其统计学意义。2．2同时

3、体外培养脾CD4+T淋巴细胞。分别加入广州管圆线虫V期幼虫可溶性抗原和ConA活化细胞后，干预共刺激信号。培养72小时后，收集细胞上清。ELISA法测定上清中IFN一口、IL—12、IL一4、IL一5和IL一13等细胞因子表达水平。3．感染小鼠眼眶取血，收集血清。ELISA法测定血清中IgG、IgGl和IgG2a的水平。4．ELISA法测定的细胞上清中细胞因子表达水平和血清中抗体水平的结果用SPSSl7．0采用广义线性模型的单变量分析其统计学意义。5．取不同感染时期小鼠脑组织，冰冻切片后进行HE染色和DAB染色

4、。观察两种小鼠脑组织的细胞形态学变化和协同刺激分子表达水平。ImageJ软件分析免疫组化结果。结果1．感染后ICOSL√一组的淋巴细胞上协同刺激分子产生明显滞后，感染后3周才出现显著性差异；而C57BL／6组针对AC急性感染，感染后3天即出现显著性差异。表明广州管圆线虫感染不同时期小鼠脾CD4+T细胞参与的免疫应答与ICOS存在密切关系，ICOS也是Th2极化重要的共刺激分子。温州医学院硕士学位论文2．C57BL／6组感染早期出现IFN-D、IL-12增高现象，血清抗体亚型水平随着感染逐渐增高，预示感染两周内T

5、hl免疫应答水平占优势，随之逐渐被Th2免疫应答水平取代；而ICOSL缺乏组Thl型细胞因子IFN一口、IL—12的升高均相对滞后，在感染早期Th2型细胞因子IL-4、IL一5、IL一13的表达量相对增高。3．结合血清学抗体检测结果观察，ICOSL缺乏组与C57BL／6组相比，前者参与体液免疫的能力较差，较低的IgGl和IgG2a水平显示ICOSL缺乏组在保护性免疫的产生过程的信号传导通路受阻，无法快速组织有效的Th2优势应答。4．脑组织切片经HE染色后光镜下进行初步组织形态学观察：正常对照鼠切片中细胞形态一致

6、，细胞核完整染成均一蓝色；感染小鼠切片中细胞胞体变小、变圆，细胞核固缩、深染。5．ICOSL√一组脑组织切片经DAB染色发现协同刺激分子表达出现明显滞后现象，感染后3周才出现显著性差异；而C57BL／6组针对AC急性感染，感染后2周即出现显著性差异。表明ICOS的缺陷可延后免疫病理反应的发生。结论本项研究获得了广州管圆线虫感染小鼠致病过程中CD4+T淋巴细胞协同刺激分子动态表达特征，推测其与“酸脑"发生发展的可能关系；发现干预ICOS介导的协同刺激信号可调控Thl／Th2的极化，为探索以协同刺激分子为靶点的调控

7、机制及寻找控制“酸脑"的发生发展的策略提供实验依据。关键词：广州管圆线虫；协同刺激因子；细胞因子；免疫组化；流式细胞术温州医学院硕士学位论文StudyontheFormationofEosinophilicMeningitisandtheRegplationMechanismintheHostofAngiostrongyluscantonensisABSTRACTobjective1．EstablishthemodelofICOSL√-mice(CD275knockoutmice)andC57BL／6micei

8、nfectionwithAngiostrongyluscantonensis，observethedynamicchangeoftheCO-stimI-tlatoryfactorexpressionofCD4+Tlymphocytes，andcombinethepathologicalanalysisofbraintissuesindifferentperiodofinfection，