儿童耐多药结核杆菌差异表达基因的筛选及克隆

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1、重庆医科大学硕士学位论文儿童耐多药结核杆菌差异表达基因的筛选及克隆姓名：张运玲申请学位级别：硕士专业：儿科学指导教师：朱朝敏201205儿童耐多药结核杆菌差异表达基因的筛选及克隆摘要目的：本研究拟避开传统在已知结核菌耐药相关基因中一一进行探索的实验方法，直接从基因差异表达角度入手，就可能参与调控结核菌耐多药性产生的基因进行一次横向、大范围的筛选；了解儿童结核杆菌耐多药调节机制与成人的异同点。方法：收集我院感染消化科从2003年7月"-'2010．12月所有培养阳性的结核菌株，在已进行耐药鉴定和基因分型的基础上，以耐多药菌株cDNA为实验组(Te

2、ster)，敏感株cDNA为驱动组(Driver)，应用抑制消减杂交(SSH)技术结合T／A克隆技术构建族耐多药与敏感菌株差异表达消减cDNA文库，利用Blastn软件将所获得的表达序列标签(EST)序列与公共数据库GenBank进行同源性分析。结果：经过两次消减杂交及PCR扩增后的产物经“A／Tclone”克隆到PMD-18T载体，转染至感受态大肠杆菌DH5，所长出的菌落中约9(P／o为白色菌落，成功构建耐多药结核杆菌cDNA消减文库。经PCR鉴定约80％有特异性扩增带且扩增带分子量在200，--1000bp之间，阳性率较高。随即挑选248个

3、阳性克隆进行基因测序，经同源性分析去除无效及重复序列，共获得113个差异表达cDNA片段，其中有5条未知EST序列，其余108个均为已知基因(5个参与结核耐药的形成)，其主要'功能分类主要为：①细胞壁及相关过程蛋白基因，如Rv0987，Rv3783，Rv2318；@PPE家族蛋白相关基因，如Rv3343cPPE54，Rvl918cPPE35：③参与中间代谢和呼吸活动相关基因，如Rv3858cRv3784，Rv3068c：④与结核杆菌毒力，解毒作用及其适应性相关基因，如Rv2477cRv0783cRv2303c；⑤细菌脂质代谢相关基因，如Rv29

4、33Rv2931Rv3515c；⑥调控相关蛋白，如Rv3765cRv2799cRv0984；⑦假想蛋白，如Rvl498ARv2603Rv0690c及一些信号通路、调节蛋白和插入序列等。结论：研究表明SSH技术是筛选差异表达基因和新功能基因的有效方法；多种已知或未知基因均参与了结核杆菌耐多药的调节，大规模筛选与克隆这些基因为进一步研究结核杆菌耐多药机制的产生奠定了必要的理论基础，可能为新的临床诊断方法的建立提供相应靶点；已知耐药相关基因中未发现儿童与成人结核耐多药调节机制的差异。关键词：结核杆菌；抑制消减杂交；耐多药；差异表达基因SCREENIN

5、GANDCLON矾GDⅡrERENTLALLYEXPRESSEDGENESOFCHILDRENMULTI-DRUGI之ESITf蝌CETUBERCULoSIsABSTRACTObjective：Inthisstudy，weaimedtoscreenfordifferentiallyexpressedgenesinmultidrug—resistanttuberculosis(IVIDR—TB)anddrug-sensitiveTB，toidentifythosegenesthathaveeffectsonMDRinTBandtodiscusst

6、hemechanismsofgeneregulationinMDRinTB．Methods：Ininfectionsandgastroenterologydepartment，Wecollectedtheculture-positivembercubsisstrainsfrom2003．7～2010．12．Inthebasisofgenotypinganddmgidentification，thecDNAfromanMDRstrainofTBwasusedastheexperimentalgroup(Tester)，whiletheeDNAfr

7、omasensitivestrainofTBwasusedasthecontrol(Driver)．Suppressionsubtmctivehybridization(SS均technologyWasusedincombinationwithmeT／AfamilyofcloningtechnologytobuildalibraryofcDNAsthatweredifferentiallyexpressedintheMDRandsensitivestrains．FromthiseDNAlibrary,genesthatwereexpressed

8、intheMDR．TBbutnotinthedrug-sensitiveTBwereselectedforgenesequencingandhomol