甘蓝型油菜耐湿差异性表达基因筛选及分析

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甘蓝型油菜耐湿差异性表达基凶的筛选及分析摘要与拟南芥、水稻等传统模式植物相比，甘蓝型油菜中耐湿基因的鉴定和耐湿机制的研究还比较少，筛选和鉴定甘蓝型油菜中与耐湿相关的基因，分析揭示其耐湿分子机制，可以为油菜耐湿分子育种提供科学依据。为发掘甘蓝型油菜耐湿相关基因，本研究选用耐湿性遗传差异较大的2个甘蓝型油菜纯系中双9号(耐湿)和GH01(敏感)，以水淹处理12小时苗期根的RNA为tester，对照为driver，构建eDNA文库，利用转录组测序(RNA-sec0方法，筛选参与湿害应答相关的基因。主要结果如下：1．湿害胁迫下中双9号和GH01中分别有12211个和11469个差异表达基因。其中，中双9号特异性差异基因3526个，GH01特异性差异基因2784个，中双9号和GH01共表达差异基因8685个。2．对差异表达基因进行了主要生物学功能分类。在湿害胁迫下，在细胞组件中与细胞膜、细胞质、细胞器相关的差异基因占有很大比例。分子功能注释中的差异表达基因较多的是结合和催化相关基因，主要包括蛋白结合、阳离子结合相关基因、金属离子结合基因等结合基因，氧化还原酶、磷酸转移酶，水解酶等催化相关基因，转运载体、电子载体相关基因和一些参与信号转导的重要基因等。而在生物过程中主要是参与细胞内代谢途径的相关基因，如：蛋白代谢途径，糖代谢途径相关基因，分解代谢途径、细胞过程、刺激应答、生物学调节、细胞机构合成等相关途径的基因等。3．在中双9号中，有4条Pathway显著富集，包括：氨基糖和核苷酸糖代谢、ABC转运、非同源末端连接、其他类型含氧糖的合成。在GH01中，有5条Pathway显著富集，包括：氨基糖和核苷酸糖代谢、ABC转运、苯丙氨酸代谢、丙氨酸，天门冬氨酸和谷氨酸代谢和光合作用。4．应用Real-timeRT—PCR方法验证分析了有功能注释的8个基因。其中有5个基因在中双9号中表现上调，而在GH01中表现下调；有3个基因在中双9号和GH01中共同表达。结果表明这8个基因在湿害胁迫下表达量改变倍数和表达谱测序中获得的差异表达倍数基本一致，从而表明测序数据真实可靠。关键词甘蓝型油菜；耐湿性；湿害；转录组测序(RNA-seq)；差异表达基因 华中农业大学2012届硕士研究生学位论文AbstractComparedwiththetraditionalmodelplantssuchasAmbidopsisandrice，thestudyontheidentificationoftheWaterloggingresistancegeneinBrassicanapusL．anditswaterloggingresistancemechanismhasbeenrare．Therefore，screeningandidentifyingtheconcemedwaterloggingresistancegeneinBrassicanapusL．andanalyzinganduncoveringitsolecularmechanismsofwaterloggingresistanceCanprovidenewscientificproofforimprovingBrassicanapus’Swaterloggingresistancethroughgeneticengineering．TofindoutwaterloggingresistancegeneinBrassicanapusL．，zhongshaung9(waterloggingtolerancelines)andGH01(non-tolerantlines)areselectedbyRNA-seq，bothofwhichbelongtothepurelinesofBrassicanapusL．、)~，imrelativegreaterdifferencesinwaterloggingresistanceheredity．Besides，vvimtheRNAoftherootofseedlingstage，waterloggedfor12hoursasatesterandthedriverasacontrol，theeDNAlibraryisconstructed．ByadoptingRNA—seqtechnology,thispaperscreenedgenesinwaterloggingresponsefromtheeDNAlibraryofzhongshuan99andGH01andfurtherstudiedsometargetgenes．Themajorresuksareasfollows：1．Thereare1221and1469differentiallyexpressedgenesinzhongshuan99andGH01respectivelytowaterlogging，ofwhich3526specificdifferencegenesinzhongshuan99and2784specificdifferencegenesinGH01．Thereare8685differencegenesexpressedinzhongshuan99andGH01altogether．2．Classifythedifferentiallyexpressedgenesfrommajorbiologicalfunctionperspective．Incellcomponents，differencegenesrelatedwithcellmembrane，cytoplasmandcellularorganaccountforalargerproportionunderthethreatofwaterlogging．Mostofthedifferentiallyexpressedgenesinmoleculeannotationaregenesofcombinationandcatalysis．Majorconcernedgenesincludecombinationgenesonproteinbinding，cationicbindingandmetallicionbinding，catalyticrelatedgenesofoxidordeuctase，phosphotransfcraseandhydrolyticenzyme，genesrelatedwithtransporterandelectroncarrierandsomeimportantgenesinsignaltransduction．Whileinthebiologicalprocess，themajorgenesarethoserelatedwithmetabolisminsidecellssuchasgenesrelatedwithproteinmetabolicpathwayandglucosemetabolicpathwayandgenesrelatedwith2 甘蓝型油莱耐湿差异性表达基因的筛选及分析catabolismpathway,cellprocesses，responsetostimulation，badjustmentandceilsmechanismsynthesis．3．Inzhongshuan99，therearefourPathwaysobviouslyconcentrated．Theyaleaminosugarandnucleotidesugarmetabolism,ABCtransporters,Non—homologousend-joiningandothertypesofo-glycanbiosynthesis．InGH01，therealefivePathwaysobviouslyconcentrateincludingaminosugarandnucleotidesugarmetabolism，ABCtransporters,phenylalaninemetabolism，alanine，aspartateandglutamatemetabolismandphotosynthesis．4．8geneswithannotationwerecheckedandanalyzedbythemethodofReal-timeRT—PCR．The8genesaleexpressedinbothofthetwomaterials，ofwhich5genesareup-regulatedinzhongshuan99anddown-regulatedinGH01and3genesarebothup。regulatedinzhongshuan99andGH01．Theresultshowsthatdifferentiallyexpressedmultiplesthatthe8genesgainedfromRNA-seqtowaterloggingalebasicallythesame，provingthatthesequenceddataalereal．Keywords：Brassicanapus．L；waterloggingresistance；waterlogging；RNA．seq；differentiallyexpressedgenes3 华中农业大学2012届硕士研究生学位论文4 甘蓝型油菜耐湿差异性表达基因的筛选及分析1月IJ舌油菜是为我国最重要的油料作物之一，主要分布在长江流域(占全国油菜总面积的85％)，常年种植面积1．1亿亩，总产1200万吨以上，产量和播种面积均居世界首位，每年可提供约400万吨食用油(占我国自产植物油总产50％)和700万吨优质蛋白饲料，在国民经济中具有十分重要的作用(殷艳，2009)。近年来，国内植物油消费水平大幅提高，我国油料生产无法满足消费需求，进口量连年攀升，进口量己占全球油料贸易总量的1／4，我国已成为世界上最大的食用植物油料和油品进口大国。由于大豆、花生、芝麻、胡麻等夏作面积扩大的空间有限(农业部全国油料作物生产规划)，油菜是我国发展空间最大的油料作物，还可以利用长江流域冬闲田扩大6000万亩的种植面积。由于长江流域冬闲田发展油菜是采用水稻与油菜轮作的耕作模式，稻田湿害是制约油菜单产的重要因素，提高油菜新品种的耐湿性，对于减轻产量损失、提高油菜品质、扩大油菜生产面积和提高我国食用油安全具有十分重要的意义。油菜不仅是我国饲料产业的主要来源，也是我国农民的重要收入来源之一o，我国是世界上最大的油菜生产国，其中70％的油菜种植在长江流域(刘后利，1985)。由于我国冬油菜生产主要为水稻一油菜的轮作制度，油菜生长季节(每年10一12月苗期和次年3月花期)受南太平洋暖湿气流和北方冷空气在长江流域长期交汇影响，有时连绵阴雨长达10—15d以上，加上水稻田土壤湿度过大和地下水位较高，土壤粘重，透气性差，导致油菜根系缺氧，根系生长不良，大量死苗或僵苗(林贤青，1993；李真，2010)，加之目前普及种植的甘蓝型油菜类型的耐湿性相对较差，油菜湿害发生十分普遍，相关研究发现湿害可造成油菜单产下降17．42．4％(林贤青，1993；程伦国，2003；张文英，2003；宋丰萍，2008)。与国外的春油菜生产相比，油菜湿害是我国特有的重大自然灾害，常年发生面积一般达至U1000．2000万亩左右(主要分布于四川、重庆、湖北、湖南、安徽、江苏、浙江等)，占长江流域总面积10．20％以上(刘后利，1997)。据气象统计，全国性大范围发生的严重油菜湿害约3年发生1次，区域性的严重湿害每年均有发生，jtH2009年春季持续低温阴雨，油菜渍害发生面积达2100万亩(农业部油菜产业技术体系全国调查数据)，单产减产10％以上，总产损失达26万吨。湿害是植物生长过程中的主要非生物胁迫因子之一。湿害是指土壤水分达到饱和时造成嫌气环境，因氧气亏缺改变了植株的代谢，对植株正常生长发育所产生的危 华中农业大学2012届硕士研究生学位论文害(周广生，2002)。湿害会直接导致缺氧，无氧呼吸产生的乙醇以及土壤还原性的增强造成大量的有毒物质产生和积累，对根系产生严重毒害作用，影响根系生命活动的正常进行(曹铴，1996)。营养元素和必需的中间代谢产物从根部淋失是导致湿害的另一个重要原因(刘林艳，2008)。湿害会导致根际缺氧，糖酵解、乙醇发酵和乳酸发酵产生的乙醇、乳酸、氧自由基等有害物质对细胞造成伤害(DennisES，2000)致使根系活力减弱，黄叶增多，株高降低，分枝部位提高，主花序变短，一次和二次有效分枝减少，角果数、粒数均有不同程度降低，花器脱落，结实率降低，其中尤以角呆数减少最多。严重时还可导致油菜可能减产17％----42．4％(王汉中，2009)。湿害导致病菌的繁殖和传播，使菌核病、霜霉病、根肿病和杂草等大量发生和蔓延，造成的湿害次生灾害是最主要的灾害。国内外对作物耐湿性的研究有着悠久的历史。最初主要通过开沟排水来改善作物生长环境这一传统的栽培措施来减轻湿害。近几年来，随着分子生物学的发展，作物的耐湿性研究主要从遗传分子分析、生化和代谢、整个植株的生理及生态效应等方面展开(JacksonMB，2009)。研究者已在水稻、小麦、大豆、玉米等作物上开展了耐湿涝遗传机理、机制及育种等大量的相关研究工作(ReynaN，2003；QiuFZ，2007)。油菜耐湿性研究，目前主要集中于湿害对不同油菜品种生理特性、产量品质形成的影响以及耐湿材料鉴定筛选等方面，如今已经有一些与耐湿性有关的基因被克隆出来，这些基因的应用性研究也势必会兴起。因此，提高油菜耐湿性，降低产量损失，对于我国油菜高产稳产具有积极的意义。1．1湿害对植物生长的危害机理1．1．1根系缺氧伤害湿害会直接导致植株根系缺氧。无氧呼吸产生的乙醇以及土壤还原性的增强，造成大量的有毒物质产生和积累，对根系产生严重毒害作用(DrewCM，1980)，影响根系生命活动的正常进行。缺氧降低了根系细胞ATP浓度，削弱了根系主动吸收矿质营养的能力，导致营养缺乏，生长缓慢，根部活力减弱，枯萎变色；初生根上侧根、根毛减少并逐步发黑死亡，有的作物会诱导产生不定根(汤章城，1983)。有的作物为了适应湿害还会产生增加组织细胞间的空隙，形成通气组织。严重的湿害胁迫后，由于根系受损导致水分吸收下降，还会造成地上部分缺水形成生理性干旱，对植物6 甘蓝型油菜耐湿差异性表达基因的筛选及分析正常生长代谢造成严重影响。1．1．2光合能力下降植物的地上部分生长和代谢与根系的代谢是紧密相关的，根系的缺氧环境也会影响叶片的光合特性。湿害发生后，土壤含氧量下降，植株对K+吸收的减少和ABA含量的增加诱导气孔关闭，蒸腾作用降低，许多植物叶片发生萎蔫(MckevlinMR，1998；吴林，2002)，气孔关闭后导致C02扩散的气孔阻力增jJl](Mekevlinm,1998)；随着淹水时间的延长，羧化酶活性逐渐降低(魏凤珍，2000)，叶绿素含量下降，叶片早衰和脱落，光合速率迅速下降。土壤淹水不仅降低光合速率，光合产物的运输也有所减慢(吕军，1994；金才，2001)。并且水淹胁迫阻碍碳水化合物从叶片转移到根部，作物中的储藏物质被大量消耗，分解大于合成，缺氧较轻时植株因饥饿而死亡；缺氧较重时，则因蛋白质分解，原生质结构遭受破坏而死亡。1．1．3细胞能量代谢效率下降缺氧时，三羧酸循环不能顺利进行，植物细胞加强糖酵解、乙醇发酵和乳酸发酵代谢来获得维持其生存所需要的能量。许多耐缺氧能力差的旱生植物，如玉米、大麦、马铃薯、豌豆等，呼吸代谢消耗的糖中70％形成乙醇和乳酸，只有5％形成丙氨酸，存在明显的巴斯德效应。因此，淹水条件下植物根系细胞的ATP浓度、ATP／ADP比值和能荷降低，蛋白质合成明显受到抑f1]lJ(RieardB，1994)。无氧呼吸的效率远远不如有氧呼吸，产生的能量极为有限，只能在短期内维持作物的生存(CrawfordRRM，1996)。1．1．4代谢中间产物产生毒害作用陆生植物因缺氧下的糖酵解、乙醇发酵和乳酸发酵代谢会形成大量的乳酸、乙醇、乙醛等中间产物，积累到一定程度可对细胞结构和其它代谢途径都有毒害作用，严重时导致植物死亡。更有甚者，缺氧后植物细胞抗氧化系统紊乱，在恢复供氧后，氧自由基浓度升高，造成细胞膜伤害，离子渗漏和细胞死(CrawfordRRM，1996)。而湿生植物的细胞和组织具有合成大量超氧化物歧化酶、抗坏血酸等抗氧化剂的能力，可以有效防御自由基对细胞膜的伤害。比如耐淹水稻品种根系活力强，吸收环境氧气的能力强，抗氧化酶活性相应地增高，也避免了活性氧伤害(SarkarRK，2000)。7 华中农业大学2012届硕士研究生学位论文1．2湿害对油菜生长的影响1．2．1湿害显著抑制油菜生长油菜在不同生育时期，对湿害的反应各不相同。以产量为指标，渍水的敏感性依次为蕾薹期、花期>苗期、角果发育和成熟期(宋丰萍，2009)。油菜种子在萌发过程中，土壤水分过多，根系缺氧，吸收能力下降，出苗缓慢，甚至死苗。苗期湿害可造成油菜根系发育不良甚至腐烂，外层叶片变红，叶色灰暗，心叶不能展开，幼苗生长缓慢甚至死苗(王汉中，2009)。部分存活的根颜色为褐色，柔韧性下降，根毛少，在发芽后期新长出不定根(张学昆，2007b)。花果期持续受渍胁迫影响油菜的正常开花结实，角果发育受阻，干瘪变黄、衰老加速，导致有效角果数减少，千粒重降低，产量下降(朱建强，2005)。但这一时期短时问(Lt女H2天)的持续受渍胁迫对油菜生长发育、产量形成以及籽粒含油量影响不大(张文英，2003；朱建强，2003)。1．2．2湿害造成油菜产量、品质显著下降Gutierrez等(GutierrezBFH，1996)发现，受湿害胁迫后油菜生长速度显著下降，菜籽含油量降低，蛋白质含量提高。但是，自然条件下花期湿害造成产量下降的主要原因是阴雨过多影响授粉，造成结实率下降从而减产。如张文英等(张文英，2003)研究发现，油菜花果期持续受渍明显干扰产量形成，但对含油量的影响相对较小。长时间持续渍害影响油菜籽粒的灌浆，导致千粒重降低。油菜花果期持续受渍，其危害主要是因单株有效角果数和干粒重等减小从而影响产量；如果受渍时闻长，单株有效角果数和干粒重降低幅度更大，减产严重。周伟军等(ZhouW，1995)研究还发现，油菜湿害后株高、茎粗和单株一次分枝数显著减少。水淹后油菜产量和品质的变化也因品种差异而不同。张学昆等(张学昆，2007a)研究发现中双8号和中双9号具有较强的耐湿性，田间湿害后单株有效果数、每角粒数和单株粒重的降低程度显著低于其它品种，而且千粒重显著提高，含油量和蛋白质变化不显著；不耐湿的品种如GH0l则每角粒数和含油量等显著降低，尽管蛋白质含量显著提高。1．2．3湿害导致油莱生理生化紊乱湿害干扰植株正常的生理机能，并且在渍水以后仍有持续的不利影响。油菜受湿害胁迫后生理生化出现紊乱。苗期渍水导致叶片叶绿素含量下降、丙二醛(MDA)及脯氨酸(Pro)含量增加(宋丰萍，2010)。钟雪花等(钟雪花，2002)研究发现：在淹水胁 甘蓝型油菜耐湿差异性表达基因的筛选及分析迫下，油菜叶片光呼吸途径中羟基丙酮酸还原酶(HPR)，光呼吸酶乙醇酸氧化酶(Go)，过氧化氢酶(CAT)酶活性升高，呼吸作用加强，叶片中丙二醛(MDA)含量升高。淹水胁迫使植物体内超氧化物歧化酶(SOD)活性升高，但在淹水胁迫后期，油菜体内SOD活性开始下降。周伟军等(ZhouW，1995)研究发现在油菜苗期和花芽分化阶段出现渍水，叶片叶绿素含量、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性显著降低，叶片丙二醛(MDA)和乙烯积累，叶片光合速率和根系氧化性降低。林贤青(林贤青，1993)等在油菜各生育期进行渍水处理，发现叶片乙烯释放量增加，根系活力下降，植株氮素积累降低，叶片MDA含量升高，植株早衰，终花期叶片光合速率比对照降低8．7％～38．1％。1．3油菜耐湿性相关机理1．3．1油菜耐湿性的遗传多样性前人通过缺氧萌发种子或其它水淹处理、测定相关性状指标筛选到丰富的耐湿资源。卢长明(卢长明，1989)禾IJ用缺氧时萌发菜籽筛选到发芽系数高、耐湿性强的油菜品系。在此基础上，范其新等(范其新，2005)调查了单位电导率、相对苗长、相对苗重、相对成苗率、活力指数等油菜耐湿性相关性状，最终根据活力指数对100个油菜品系进行了分类，并以活力指数大于0．5为耐湿标准，筛选出中双9号等10个耐湿品系。随后陈洁等(陈洁，2006)对44个甘蓝型油菜种质资源水淹处理后，发现耐湿活力指数分布大致为正态分布，即大部分为中等耐湿材料，只有少数为耐湿或湿害敏感材料；甘蓝型油菜种质资源种子主要发芽性状对水淹缺氧处理反应差异很大，存在十分丰富的遗传多样性。而张学昆(张学昆，2007a)等则通过室内发芽和田间实验鉴定了9个品种的幼苗耐湿性，其中P79、中双8号、中双9号和华油杂10号耐湿能力较强。李真(李真，2010)等采用盆栽试验，在控水条件下测定双单倍体群体株高、根长、地上部干重、根干重、根冠比和总干重6个性状，对甘蓝型油菜DH群体的118个株系及其亲本进行苗期耐湿性评价，也筛选到极端耐湿基因型和极端不耐湿基因型。1．3．2油菜耐湿性的遗传机理作物耐湿性为数量遗传性状，其遗传机理较为复杂，目前在水稻、小麦、玉米、大麦、大豆、油菜等作物上开展了一系列广泛的研究。Boru等(80ruG，2001)研究了小麦耐渍性的遗传表达，结果表明耐渍性表现受加性基因效应控制，超过4对基因控9 华中农业大学2012届硕士研究生学位论文制着耐渍性。张江丽等(张江丽，2003)分析表明，引物$1249的多态性位点与耐湿性呈极显著相关，并初步确定与马卡小麦耐湿性相关的这个位点定位在5A染色体上。Vantoai等(VantoaiTT，2001)N用大豆两个重组自交系株系对耐渍QTL进行定位研究表明：可以用标记Sat-064进行耐渍品种的分子标记辅助选择。Qiu等(QiuFZ，2007)利用玉米的F2：3家系对5个耐渍相关性状进行-]'QTL定位，共检测到的59个QTL位点，所检测到的单个QTL解释3．9％～37．3％的表型变异。Xu等(XuKN，2006)对水稻耐淹基因的进一步研究发现，SublA是一个类似乙烯响应因子的基因，并通'过MAS将其导入农艺性状良好但不耐湿的栽培种中，极大地提高了耐淹性。关于油菜耐湿性的分子遗传和耐湿基因定位研究在国内外报道较少，尤其是对油菜耐湿性的遗传规律研究未见报道。丛野等(丛野，2009)研究认为，甘蓝型油菜中双9号xGH01组合耐湿性的遗传可能由2对完全显性主基因控制，伴随加性．显性多基因修饰作用。主基因存在显性效应，表明中双9号×GH01组合的耐湿性存在杂种优势，多基因显性效应为负，表明多基因显性效应使耐湿性降低。李真(李真，2008)采用复合区间作图(ClM)的逐步回归法检测油菜群体中与株高、根长、地上部干重、根干重、总干重有关的耐湿QTL共26个，其中4个QTL分布于1、15、18、20连锁群，单个QTL的贡献率为5．45％．22．89％。1．3．3油菜耐湿性与生理生化的关系油菜种子发芽过程中的耐湿性与种皮颜色有显著的关系，其原理在于黑色种皮中具有疏水性的色素物质，能够有效防止水分迅速进入胚中，降低了吸胀伤害，从而维持种子较高的活力(ZhangXK,2008)。Leul等(LeulM，1999)研究发现，湿害胁迫下，油菜幼苗MDA含量和相对电导率显著提高，SOD、CAT和POD酶活性显著下降；但采用烯效唑处理提高耐湿性后，MDA含量和相对电导率显著下降，SOD、CAT并NPOD酶活性均显著提高，叶片光合速率和根系活力较高。张学昆等(张学昆，2007)的研究得到相同结果，而且还发现耐湿品种可在湿害下保持较高相关酶活性和稳定的膜结构。1．4转录组测序(RNA-seq)技术研究进展1．4．1转录组测序技术的涵义转录组即特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和，是某个物 甘蓝型油菜耐湿差异性表达基因的筛选及分析种或者特定细胞类型产生的所有转录本的集合(祁云霞，2011)。转录组研究能够从整体水平研究基因功能以及基因结构，揭示特定生物学过程以及疾病发生过程中的分子机理，现已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。通过RNA．Seq技术，能够从整体水平研究基因功能以及基因结构，揭示分子机理。1．4．2数字化表达谱技术的应用现状数字化表达谱技术是这几年新兴的一项技术，在动物上应用的更为广泛，例如癌症的研究、斑马鱼基因组的研究、白粉虱基因组及转录组的研究(MorrissyAS，2009；HegedusZ，2009；WangXW,2010)。2010年，A．SoranaMorrissy等(MorrissyAS，2009)通过比较数字化表达谱技术与LongSAGE技术在癌症研究上的区别，阐明了数字化表达谱技术的原理及优越性；2009年，ZoltanHegedus等(HegedusZ，2009)人利用数字化表达谱技术研究斑马鱼的转录组，并将表达谱的结果与利用基因芯片研究和荧光定量研究的结果进行分析比较，得出数字化表达谱技术可靠和优越的特点；2010年，wang等(WangXW,2010)汞J用数字化表达谱技术大规模分析了白粉虱的转录组，并为没有全基因组测序的物种利用此技术开展研究奠定了基础。在植物基因表达谱上也已经有了一些应用：2010年，Wang等(WangQQ，2010)禾U用此技术研究了棉花纤维早期发育的表达谱，在大规模分析棉花纤维基因表达谱工作中取得了很大进步；2010年，Wu等(WuJ,2010)禾lJ用数字化表达谱技术分析正常的(对照组)和感病(处理组)植株，筛选得到了葡萄中许多抗病的目的基因和显著通路；为了鉴定出决定黄瓜开花性别的基因，2010年，Wu等(WuT,2010)通过构建黄瓜突变体和野生型的数字化表达谱文库，通过GO分析这些差异表达的基因，发现激素和转录因子在决定黄瓜开花的性别中起主要的作用。1．4．3RNA-Seq技术优势RNA—Seq技术具有诸多独特优势。(1)数字化信号：直接测定每个转录本片段序列，单核苷酸分辨率的精确度，可以检测单个碱基差异、基因家族中相似基因以及可变剪接造成的不同转录本的表达(WilhelmBT,2008)，同时不存在传统微阵列杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题，能覆盖信号超高的动态变化范围。(2)高灵敏度：能够检测到细胞中少至几个拷贝的稀有转录本。(3)任意物种的全基因组分析：无需预先设计特异性探针，因此无需了解物种基因息，能够直接对任何物种进 华中农业大学2012届硕士研究生学位论文行转录组分析，这对非模式生物的研究尤为重要，例如W-趾g等(WangXW,2010)、Xiang等CA(dangLX，2010)和Vera等(VeraJC，2008)N用RNA-Seq技术分别对白粉虱、海鲈鱼和蝴蝶转录组进行了研究。同时能够检测未知基因，发现新的转录本，并精确地识别可变剪切位点及cSNP,UTR区域(CloonanN，2008；MorinRD，2008)。(4)更广的检测范围：高于6个数量级的动态检测范围，能够同时鉴定和定量稀有转录本和正常转录本；而芯片对过低或过高表达的基因缺乏敏感性，因而动态检测范围小(WangZ，2009)。此外，RNA—Seq重复性好fNagalakshmiU，2008；WangZ，2009)，无需技术重复，而且起始样品比芯片技术要少得多(WangZ，2009)，尤其适用于来源极为有限的生物样品分析，如癌症干细胞。1．4．4转录组测序技术的应用转录组测序技术能够将获得的数据进行全面的数据挖掘，既能够进行基因结构分析，鉴定UTR、可变剪切位点，也能够发现新的转录本及非编码RNA，比较样本问的表达水平差异。归纳为：(1)非编码区域功能研究：Non-codingRNA研究、microRNA前体研究等。(2)转录本结构研究：UTR鉴定、Intron边界鉴定、可变剪切研究、Startcodon鉴定等。(3)基因转录水平研究。(4)全新转录区域研究。RNA．Seq作为一种新的高效、快捷的转录组研究手段正在改变着人们对转录组的认识。RNA-Seq利用高通量测序技术对组织或细胞中所有RNA反转录而成的cDNA文库进行测序，通过统计相关读段(reads)数计算出不同RNA的表达量，发现新的转录本；如果有基因组参考序列，可以把转录本映射回基因组，确定转录本位置、剪切情况等更为全面的遗传信息，已广泛应用于生物学研究、医学研究、临床研究和药物研发等．1．5本研究的目的及意义油菜的主要种植地位于长江流域，而长江流域又是湿涝灾害的多发地和重灾区，因此油菜的生产受湿涝灾害影响较大。与白菜、芥菜型油菜相比，甘蓝型油菜产量和抗菌核病具有显著优势，但耐湿性相对较差(AshrafM，1990)。油菜耐湿性研究，12 甘蓝型油菜耐湿差异性表达基因的筛选及分析目前主要集中于湿害对不同油菜品种生理特性、产量品质形成的影响以及耐湿材料鉴定筛选等方面。与拟南芥、水稻等传统模式植物相比，油菜中抗逆基因的鉴定和抗逆机制的研究还比较少。因此，筛选和鉴定油菜中与耐湿相关的基因，分析其耐湿的分子机制，为通过基因工程手段来改良油菜抗耐湿性提供了新的实验数据。2实验材料与方法2．1实验材料选用两个耐湿性遗传差异较大的油菜品种(系)，甘蓝型油菜(BrassicanapusL．)中双9号，由中国农业科学院油料作物研究所育成，经连续3年鉴定，该品种发芽种子的耐湿性相对活力指数为0．87，田间耐湿性也达到高抗水平；耐湿性较差的GH01，其耐湿性相对活力指数为0．09(张学昆，2007a；张学昆，2007b)。2010年在中国农业科学院油料作物研究所试验农场(湖北省武汉市武昌区)种植实验材料，按常规方法进行田间管理。两叶期时移苗至钵中，待有5片真叶时，分实验组和对照组。实验组用凉白开水进行水淹处理(浸没根部)，对照组则保持正常生长，供给生长所需的水份。水淹处理12小时后，取实验组和对照组的根部组织，迅速洗净，置于液氮中速冻，．80℃超低温冰箱保存备用。2。2器皿准备0．1％的DEPC水溶液：1000ml双蒸水中加lmlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。0．1％的DEPC水溶液：配制好的0．1％的DEPC水，121℃，30min。所有离心管，枪头在0．1％的DEPC水溶液中浸泡12h以上，然后121℃灭菌30min，烘干备用；玻璃器皿，研钵，研棒，镊子等用具180℃烘烤8h以上。2．3To'l：alRNA的提取本试验采用Trizol(Invitrogen)试剂方法提取油菜根部总I淑A，具体步骤如下：1．用液氮将材料研磨成粉末，转入加有trizol的离心管中(每100mg材料加A．1mltfizol，以下试剂用量都按100rag起始材料为标准加量，材料要尽量少，增力lltrizol量)；2．剧烈震荡、混匀，室温静置5．6分钟，使核酸蛋白复合物完全分离，注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂；3．4℃，12000rpm离一t],10min，取上清至新的离心管中；(避免取到中间层，引起DNA 华中农』k大学2012届硕士研究生学位论文污染)4．JJIJ入2009l(trizol体积的115)氯仿，剧烈振荡混匀，静置5min；5．40C，12000rpm离一IM5min，样品分成三层：黄色的有机相，中间层为蛋白和上面无色的水相，此时的RNA主要存在于水相中。将上清转移至新管中(约400p,1)，注：千万不要吸取中间界面；6．加入0．5ml(与trizol等体积)预冷的异丙醇，混匀，室温静置20min；7．4"C12，000rpm离一010min，弃上清，RNA沉于管底；8．加lml75％乙醇(用DEPC处理过的水配制)，漂洗沉淀片刻(温和振荡离心管，悬浮沉淀)：9．40C，8000rpm离。L,5min，弃上清，再重复洗一次，尽量弃上清；10．室温静置或真空干燥5．10min，使RNA干燥，加适量的DEPC处理水溶解RNA(301．t1)，注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解，．800C保存备用。2．4RNA的纯度测定和电泳检测样品送深圳华大基因研究院测序，测序数据报告由华大基因提供。AgilentTechnologies2100Bioanalyzer检测RNA样品质量，测定RNA溶液的OD260／280比值，确定RNA的含量和纯度。OD260／280在1．9—2．1之间，可以认为RNA的纯度较好，比值较低，说明蛋白杂质较多，OD260／280较高，则表明RNA已经降解。RNA提取后取5ul点样，电泳检测。(1)用蒸馏水将制胶模具、梳子、电泳槽冲洗干净后，将模具、梳予置于电泳槽中并加入双氧水，浸泡30min。(2)除去双氧水，用DEPC水冲洗电泳器具并晾干。(3)配$1J1．2％RNA电泳胶(100m1)：用1×TAEbuffer制作1．2％琼脂糖凝胶。(4)用移液器吸取RNA样品于微量离心管中，加入1．0此6×LoadingBuffer，混匀后小心加入电泳槽中被浸没的凝胶加样孔内。(5)电压120V，电流150mA，30min，并观察电泳结果。2．5RNA纯化及cDNA的合成1)DNase(Fermentas，DNaseI，RNase—free)消化除去总RNA中残留的DNA，按下列体系：14 甘蓝型油菜耐湿差异性表达基因的筛选及分析成分体积(山)RNA10×reactionbufferwithMgCl2DNaseI，RNase-free1肚g1止1山(1u)t010山变性后的RNA溶液5xRTBufferdNTPMixture(10mM)RNaseInhibitor(10U／I．d)ReverTraAceTotalVolume3)反应条件：A：将上述体系混匀好后，42。C水浴90min；B：99。C水浴5min；C：4"C(冰上)5min，置于一20。C保存备用。成分体积(山)ddH20lOxTaqbufferdNTPMixture(IOmM)Primer1Primer2cDNATotalVolume6．251．00．20．9O．51015屹42●，加 华中农业大学2012届硕士研究生学位论文2．6PCR检测反转录的cDNA的完整性PCR反应条件：A：94。C2min，B：94。C10s，C：60。C30s，D：72。C2min，E：4。C60min。B-D：37cyeles1．2％的琼脂糖凝胶电泳检测cDNA的完整性。2．7实时荧光定量PCR(qPOR)检测用Primer5．0并HOligo6．0软件设计荧光定量的引物，因为所用的参考基因数据库是拼接得到的基因，因此设计的引物可以利用其中最合适的一条进行，引物设计由Invitrogen公司负责完成，荧光定量实验使用的TOYOBOSYBRGreenRealtimePCRMasterMix试剂，在BIO-RADCFX96Real-timePCRSystem_L进行。该实验中共采集3次样品，分别提取RNA，每个样品重复3次，实时定量RT-PCR实验，最后统计9次实验结果，计算平均值和标准差。引物序列如表1．1所示。表1—1荧光定量PCR弓I物列表Tablel-1ThelistoftheprimerofRT-qPCR16 甘蓝型油菜耐湿差异性表达基因的筛选及分析采用反转录成的cDNA，对差异表达基因先进行梯度PCR摸索试验，以确定这些基因的最佳退火温度和时间以及PCR扩增的最佳的反应体系。然后进行实时荧光定量PCR验证这些基因的相对表达量。1．梯度PCR反应体系如下：按组分配置PCR反应液(在冰上进行)1)PCR反应体系成分体积(扯1)ddn20SYBRMixturePrimer-LPrimer-RTemplateTotal6．4ul10ulO．8ul0．8ul2ul20ul2)PCR反应程序Stepl：95。C2minStep2：95。C10secStep3：60=C30secStcp4：72。C15sec17 华中农业大学2012届硕士研究生学位论文Step5：PlatereadStep6：GotoStep2foradditional35cyclesStep7：Meltingcurevefrom55。Cto95。C，Platereadevery0．2℃，holdfor2seeStepS：12。Cforever2．8转录组文库生物信息学分析将制备好的四个样品委托深圳华大基因公司进行数字表达谱测序及生物信息学基本测序数据结果的分析。以白菜的genome为参考基因(http：／／brassicadb．org／brad)华大基因表达谱测序项目的结题报告，分为以下几个方面的数据报告，它们分别是：测序评估、基因表达量统计、差异表达基因筛选、差异基因表达模式聚类分析(表达量注释和功能注释)、差异表达基因筛选(co功能分析和Pathway分析)。本研究只对结题报告的部分数据进行转录组分析工作。其中，大部分过程均做过简单分析，本文主要选取甘蓝型油菜耐湿相关数据分析整理。2．8．1差异表达量的统计表达量注释：基因表达量的计算使用RPKM法(ReadsPerKbperMillionreads)(MortazaviA，2008)，其计算公式为：置撩譬=旦委琵，l∥设RPKM(A)为基因A的表达量，则C为唯一比对到基因A的reads数，N为唯一比对到参考基因的总reads数，L为基因A的碱基数。RPKM法能消除基因长度和测序量差异对计算基因表达的影响，计算得到的基因表达量可直接用于比较不同样品间的基因表达差异。2．8．2差异表达基因筛选通过比较不同样本间的数据从而筛选出差异表达的基因，后续分析中的差异基因表达模式聚类分析，GeneOntology功能显著性富集分析，Pathway显著性富集分析，蛋白互作网络分析均是基于差异表达基因。参照AudicS．等人发表在GenomeResearch上的基于测序的差异基因检测方法(AudioS，1997)，华大基因公司开发了严格的算法筛选两样本问的差异表达基因。假18 甘蓝型油莱耐湿差异性表达基因的筛选及分析设观测到基因A对应的reads数为X，已知在一个大文库中，每个基因的表达量只占所有基因表达量的一小部分，在这种情况下，p(x)的分布服从泊松分布：夕∞=篓芋(名为羹医矗黻耥)jc!已知，样本一中唯一比对到基因组的总reads数为Nl，样本二中唯一比对到基因组的总reads数为N2，样本一中唯--tL对到基因A的总reads数为X，样本二中唯一比对到基因A的总reads数为Y，则基因A在两样本中表达量相等的概率可由以下公式计算；j-￥2∑苁i|对{-夺i．-y或2x(i匹pOIx))抽0扣≯(如果∑烈≠}力>o．s)1．。删扣静意务然后，对差异检验的p-value作多重假设检验校正，通过控制FDR(FalseDiscoveryRate)来决定P—value的域值。假设挑选了R个差异表达基因，其中S个是真正有差异表达的基因，另外V个是没有差异表达的基因，为假阳性结果，希望假阳性比例Q=V／R不能超过某个给定的值(如l％)，则在统计时预先设定的FDR不能超过0．01(BenjaminiY,2001)。获得差异检验FDR值的同时，我们还将根据基因的表达量(I心KM值)计算该基因在不同样本间的差异表达倍数。FDR值越小，差异倍数越大，表明表达差异越显著。我们规定：差异表达基因为FD&，o．001且倍数差异不低于2倍的基因。2．8．3Geneontology功能显著性富集分析GeneOntology(简称GO)是一个国际标准化的基因功能分类体系，提供了一套动态更新的标准词汇表(controlledvocabulary)来全面描述生物体中基因和基因产物的属性。GO总共有三个ontology，分别描述基因的分子功能(molecularfunction)、所处的细胞位置(cellularcomponem)、参与的生物过程(biological19 华叶1农业大学2012届硕士研究生学位论文process)。GO功能显著性富集分析提供与参考基因比较后，在差异表达基因中显著富集的GO功能条目，并筛选出差异表达基因与哪些生物学功能显著相关。该分析首先把所有差异表达基因向GeneOntology数据库(http：／／www．geneontology．org／)的各个term映射，计算每个term的基因数目，然后应用超几何检验，找出与整个基因组背景相比，在差异表达基因中显著富集的GO条目，其计算公式为：P=1——其中，N为所有基因中具有GO注释的基因数目；13为N中差异表达基因的数目；M为所有基因中注释为某特定GOterm的基因数目；m为注释为某特定GOterm的差异表达基因数目。计算得到的P．value通过Bonferroni校正之后，以correctedp-value_<0．05为阈值，满足此条件的GOterm定义为在差异表达基因中显著富集的GOterm。通过GO功能显著性富集分析能确定差异表达基因行使的主要生物学功能。GO功能分析中同时整合了表达模式聚类分析，研究人员能方便地看到具有某一功能的所有差异基因的表达模式。通过GO功能显著性富集分析能将差异表达基因分按照GO三个ontology进行分类，分析主要生物学功能，并进行根系相关功能基因的研究。KEGGPathway分析：在生物体内，不同基因相互协调行使其生物学功能，基于pathway的分析有助于更进一步了解基因的生物学功能。KEGG是有关pathway的主要公共数据库(KanehisaM，2008)，pathway显著性富集分析以KEGGpathway为单位，应用超几何检验，找出与整个基因组相比较后差异表达基因中显著性富集的pathway。该分析的计算公式同GO功能显著性富集分析，在这里N为所有基因中具有pathway注释的基因数目；n为N中差异表达基因的数目；M为所有基因中注释为某特定pathway的基因数目；m为注释为某特定pathway的差异表达基因数目。Qvalue<0．05的pathway定义为在差异表达基因中显著富集的pathway。通过pathway显著性富集能确定差异表达基因参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。訾『惜矿譬二一一l、一}脯∑瑚 甘蓝型油菜耐湿差异性表达基因的筛选及分析3结果与分析3．1水淹处理后的表型对油菜进行水淹处理(浸没根部)，对照组则保持正常生长，供给生长所需的水份。水淹处理12d,时后表型如图3一l。对照组实验组图3-1实验组和对照组的表型Fig．3-1Thephenotypeoftesterandcontrol3．2RNA提取结果与分析电泳检测结果显示(图3．2)，RNA提取质量较好，285、185、55条带清晰可见，没有拖带等现象，说明提取的I斟A很完整，没有降解。另外，28S条带的亮度是18S的两倍左右，说明RNA的纯度较高，没有DNA、酶、蛋白质以及酚类物质的污染。AgilentTechnologies2100Bioanalyzer检测IⅢA样品质量结果如图3—2，对应的主要检测参数见表3．1。其中RIN(RNAintegritynumber)指的是RNA完整性指数，是RNA质量的重要指标。综合图3．2和表3．1，本实验中的四个扬样品中的28SrRNA和18SrI矾A主带明显，无降解，RIN合格，浓度达到要求，符合RNA．Seq测序cDNA文库构建的要求，可以用于文库构建及测序。2l 华中农业大学2012届硕士研究生学位论文图3．2甘蓝型油菜根系总RNA提取1、2：中双9号对照组和实验组的总RNA；3、4：GH01对照组和实验组总RNAFig．3-2TheelectrophoresisdetectionsoftotalRNA1、2：TotalRNAfromCKandtreatmentofzhOngshuang9『U】1501,005003、4：TotalRNAfromCKandtreatmentofGH01Z52001000qooo【IIqOverallResultsforsampleI：CKofzhongshuang9疑心矗盎r铋：疑N照Con：entriltiorl：限NAP,atior28s，18s1：强N最ZntogritvNumber(RIN)FtesultF10旧口InqColor：C乏≤强uftFI苫璺gin璺L昼bel：6。。。3554ng／pl1．810(B．02．07)E三二jRIN：10Fragmenttableforsample1：CKofzhongshuang9N魂n暑eStartSizeInt】EndSizeInt】A|’e矬％oftot&lAreaj8S1596≮977j22820528S279735422：247374EF0】200150100§O02SZOO0000【nt】OverallResultsforsample2：treatmentofzhongshuang9；；^。iiij{；_J，^!；；，iij；““¨“，，__一。J 甘蓝型油菜耐湿差异性表达基因的筛选及分析[FU】l∞OR}《^Area：甜温Concentration：rRf蝻Raa口[28s／los]：RNAIntegrityNumber(RIN)ResultRacg：jir岣：=C．olorRes：ultR印gin0L出电|：贷5。lm7n霉，uI1。9g,5(B。02．07)亡i瞰N：9．50n嘲嗽tS镰瞳Sl碧-【啉lEndSIR【靠略Araea乌颤ofImCalArw，客32BS{糖tZ蠲5，，拳§巷3‘擘17{辱乏孳{，03{善曩舵BFragmenttableforsample2：treatmentofzhongshuang92520010004000NameStartSize[眦】EndSize【吐】^他a％oftotalArea{Bg2e3{．58{2485'，9'83．937'82．11703{3．032．8OverallResultsforsample3：CKofGHO1RNR对e8：R№co悯t堵∞nl限『IAR耐曲球籼“8砖：R嗽IntegOJv。|Kur艇(R!Kl：RemitFl田gingE0tor；R目№R嘲阳曲d：S叶。747,4吲U1。￡10(B．02，07，^noⅨ孵TnreCok(s)rr∞uallvaddedj[二]疆R：10Fragmenttableforsample3：CKofGHO1NameStartSire【嗽】EndSize【l喝Area％oftotalArea{8S28S{．5822．767{9783．5101072212{垤9∞，2 华中农业大学2012届硕士研究生学位论文莎U】1SO1005002520010004000即t】OverallResultsforsample4：CKofGH01RptAAr锄：对哦conc翔tration：rRN,AR锄口拉8s，18宝3：卧{鱼In的riWNumt§er(毗哟：ResultRⅨJgingColor：Result同磺ing嘣)e|：高4，《718ngfuI1．Bt,3(8。02。07)[]Ⅺ恃：930Fragmenttableforsample4-treatmentofGH01№me壹b吨Sl恐Cnt]EndSize【ntiArea％oftotaIArea^99{．S4鸯28S2车31{9{73．995’35．1{77242．23{7图3-3AgilentTechnologies2100Bioanalyzer检测RNA样品Fig．3—3QuantitationofRNAsamplesbyAgilentTechnologies2100Bioanalyzer表3-1AgilentTechnologies2100Bioanalyzer测得的RNA样品质量Table3-1ThequalityofRNAsamplesdetectedbyAgilentTechnologiesl2100Bioanalyzer3．2RNA—Seq转录组测序结果与分析3．2．1测序结果评估原始图像数据经basecalling转化为序列数据，为rawdata或rawreads。某些原始序列带有adaptor序列，或含有少量低质量序列，要经过一系列数据处理去除杂质数据，得到的cleanreads才是后续信息分析的基础。24l￡iill：i“疆：．垂引．“一!_l；；。童E曩誉*驯∞*一舶h；二11-’ 甘蓝型油菜耐湿差异性表达基因的筛选及分析数据处理的步骤如下：1．去除含adaptor的reads2．去除N的比例大于10％的reads3．去除低质量reads(质量值Q≤5的碱基数占整个read的50％以上)ClassificationofRawReads(CKofzhongshuang9)j¨¨O嘶Adaptof026565，0．65％)■一Con嘲嘲N{153。O，00％)§囊萋||}L删Q憾姆《129917，O．66％》—●CleanReads{19364949。98．69％}ClassificationofRawReads(treatmentofzhongshuang9)OnlyAdaptor《80886。0。80％)_ConfiningN(78，0．00％}iiiiiiiiiiiiiiii；Low蕊蕊姆《93146．0,69％}—●CleaAReads《13283443，98．71％)ClassificationofRawReads(CKofGH01)OnlyA翻#鼢《86338，0．49％}l—ContainingN{122。ODo％{*LowOuatlity(1080§8．0，61％{—●cl。园nReads(17501595．9890％}ClassificationofRawReads(treatmentofGH01) 华中农业大学2012届硕士研究生学位论文0嘶A翻ptotf82835。0，55％》—一Con镳iningN(95，o，00％》iLow龟l蹦静{t05376。O，70％》■一c汹RReads《14944,864；98．76％》图3．4样品测序结果评估Fi93—4Thesequencealignmentofsamples当将reads匹配到白菜(Brassicanapus)的基因组上时，reads的匹配有几种情况：(1)reads在基因组上具有唯一的匹配位点，能够唯一的代表基因组上特定序列的转录水平，为uniquelymappedreads；(2)reads在基因组上具有位置不同的多个匹配位点，可能代表在基因组上有多个拷贝的基因，也可能是代表序列相似度高的多个基因，可信度较低，称为multi．mappedreads；(3)还有的reads不能匹配到基因组上，为unmappedreads，在转录组分析时应该舍弃。能够匹配到基因组上的reads，根据其匹配程度分为：(1)reads完全跟基因组上的序列匹配，这样的reads称为“exactmatch”reads；(2)reads可以与基因组上的序列匹配，但在匹配序列中存在错配(至多2bp的错配)或插入错误(至多1bp的插入)，这样的reads称为mismatchreads。RNA—Seq测序得到的reads中，匹配到白菜(Brassicanapus)每个基因上的uniquelymappedreads的数目，可以表示基因的转录表达水平。表3-2对reads在白菜基因组及基因上的匹配状况作了统计。表3．2RNA．Seqreads匹配概述Table3-2SummaryofRNA—SeqreadsmatchingwithBrassicanapusL．genomeandgene26 甘蓝型油菜耐湿差异性表达基因的筛选及分析在表中，+表示reads数目，％代表百分比，ZSTES表示中双9号实验组，ZSCON表示中双9号对照组，GHTES表示GH01实验组，GHCON表示GH01对照组。3．2．2基因覆盖深度检测为了估计测序深度是否足够转录覆盖，分析了四个样品的饱和度，结果见图表明。对测序饱和度进行分析，查看随着测序量的增加，检测到的Tag数据是否随之上升。如果检测到某一阀值，增加测序量而得到Tag种类并未增加，说明测序覆盖度已经检测大部分基因。Amount研Ck“lrl黜ad《x1∞k}中双9号对照组CKofzhongshuang9A栅mafClean鼬ad宴《t1∞畸中双9号实验组treatmentofzhongshuang9 华中农业大学2012届硕士研究生学位论文AmountofCleanRe醋s(xlOOk)AmountofCle飘Reads{xlOOk)GH01对照组GH01实验组CK0fGH01treatmentofGH01图3．5测序饱和度分析Fig．3-5SequencingSaturationAnalysis3．2．3随机性评估0D．0020．48$0蕾’．口伯幽噼刊略惦RelativePositioninGene(5'->3')'0b妊Rk^糟RelativePositioninGene(if->3’}00氍2孬4伽锵1蚤《Ⅸh自目㈣Rela舡VePositioninGene《5'-》300002氇■#点O息1奄t00=i柑ow=RelativePosiUoninGene(5'->3’)图3-6测序饱和度分析A：中双9号对照组溯序饱和度分析；B：中双9号实验组测序饱和度分析；C：GH01对照组测序饱和度分析；D：GH01实验组测序饱和度分析Fig．3-6SequeneingsaturationanalysisA：SequeneingsaturationanalysisofCKofzhongshuang9；B：Sequeneingsaturationanalysisoftreatmentofzhongshuang9；C：SequeneingsaturationanalysisofCKofGH01；D：SequeneingsaturationanalysisoftreatmentofGH01Hv蕾譬_c∞世_l聃量枣聱O零黧篙戮篓篙。毋≈付蕾瞄Jo．I静clE，z协奄毋霉芷JoJaoE等z一。砩口硝o《lo葛a暑flZ一。珊冒辱蕾g_o．18qP嚣：z 甘蓝型油菜耐湿差异性表达基因的筛选及分析对中双9号和GH01的实验组及对照组的测序随机性进行了评估，发现四个样品的测序随机性均较好，即reads在参考基因上的相对分布较为均匀，表明通过相对RNA进行打断然后建库的策略能够得到良好的随机性分布，从而保证测序质量。如下图3．5所示。3．2．4差异表达基因筛选所有CleanTag经_过以Unigene为标签库进行注释以后，参照AudicS(AudieS，1997)差异基因检测方法(FD№卯．001andIl092Ratio[>1)，将所有差异表达的基因进行筛选。通过实验组与对照组两两对比，筛选出大量差异表达基因(图3—6)。中双9号实验组与对照组的表达量比较：存在1221l条差异表达的tmigenes，其中有3824条为上调表达，8387条为下调表达。GH01实验组与对照组的表达量比较：共存在11469条差异表达的unigenes，其中有3693条为上调表达，7776条为下调表达。在中双9号和GH01中差异表达倍数最高的基因均为表达上调的基因，在中双9号中差异表达倍数最高的为假定蛋白，表达上调的倍数高达近19倍，在GH0l中差异表达倍数最高的也为假定蛋白，表达上调倍数高达近17倍。对比中双9号和GH01的表达差异基因(图3．7)，中双9号特异性差异基因3526个，有1333个基因上调，有2193个基因下调；GH01特异性差异基因2784个，有1201个基因上调，有1673个基因下调。在中双9号和GH01中共同表达的差异基因有8685个(图3-8)。在中双9号和GH01中共同表达的8685个差异基因中我们发现有25个差异表达的基因在中双9号中上调，在GH01中下调：有26个差异表达的基因在中双9号中下调，在GH01中上调。对这51个基因进行blast，除去未知和假定蛋白，剩下24个基因(如表3—3)可供分析的。大部分与转录因子，信号转导，乙烯的合成，细胞壁的形成，蛋白转运等有关。这24个基因将是分析的重点。29 华中农业大学2012届硕士研究生学位论文表3．3重要的差异表达基因Table3-3Differentiallyexpressedgenesofimportant 甘蓝型油菜耐湿差异性表达基因的筛选及分析l㈣8啊∞洲●a帕硼0图3—7差异表达基因筛选注：FDR≤0．001andIi092Ratiol>lFig．3-7TheselectionofdifferentexpressedgeneNote：FDl巡O．001andlI092Ratiol>l31r辱口■E—Kd到 华中农业大学2012届硕士研究生学位论文图3．8特异性差异基因rig．3—8VenndiagramofthequantitativegpneclassificationintothosespecificallyexpressedinonelibraryOrthoseexpressedinbothlibraries．3．2．5GeneontoIogy功能显著性富集分析GO分子注释是目前用于实验数据中相关信息相整合，提供包括基因、蛋白、功能、表达、蛋白相互作用、信号转导、调控、疾病、甲基化等生物学信息分析，有助于了解表达基因之间的相互关系。对差异表达基因进行Geneontology功能显著性富集分析，GO总共有三个ontology(本体)，分别描述基因的分子功1r⋯范(molecularfunction)、所处的细胞位置(cellularcomponent)、参与的生物过程(biologicalprocess)．对中双9号实验组和对照组进行分析发现有95个基因无功能注释，GH01实验组和对照组中有101个基因无功能注释，表明这些基因尚未得到充分的研究。在湿害胁迫下，在细胞组件中与细胞膜、细胞质、细胞器相关的差异基因占有很大比例，其中intracellular相关的差异基因在中双9号和GH01中差异最大，分别占68．7％和73％。当植物遭受湿害后，首先表现在细胞膜上的变化，细胞需要激活诸多基因来参与对缺氧的抵御作用，导致这大量的基因的表达参与膜成分作用。分子功能注释中的差异表达基因较多的是结合和催化相关基因，主要相关基因有：蛋白结合、阳离子结合相关基因、金属离子结合基因等结合基因，氧化还原酶、磷酸转移酶，水解酶等催化相关基因，转运载体、电子载体相关基因和一些参与信号转导的重要基因等。其中nucleotidebinding相关的差异基因在中双9号和GH01中差异最大，分别占23．1％和18％。这些差异表达的基因可能在耐湿过程中具有关键作用。32 “埘￡dj茸瞵幢善黼群陆晰靴薛蚶阵脚团器藩酶潞串尊讲恃藩薄；I{呈寻时煳№姚灯耸啬吕窘肇j金敲器盖琳啉园．甘一贼Ⅲ窘肇醛j|至。薄窘鼙j金荫盖冰噼团。串稿窘鼙降带，耸哥薄黼，鲨藩离嗡，忭藩慊萄耐，耸蔷彗苍玲岛嘏盖冰酶荫墨嫩团嘏。陇恨姗降腓靴妞蚶吕嫩团掣嚣讲虱筒j空碑；|{呈[p洒斟嘞煳齐oollll_∞叶oo暑口。喜eIlt 罟雹￡簧营孚宝长寻浔导汁垛No_N前淘件窜哥旰帐高黔泔 I^ai删I饿翔§：捌篷删a：o,d簿koqm．u哪§pit：o,d。l，邶筘山I瓶啪Ii瀚霜莲DqeI飘”aIE调l悸瞒0eⅢ删聆al捌l蜘i：删麓婶削a|嘲嫩强．舢蝶p，i：蒯篾嗍Pj{l挑舯悄l斟掣§：棚蕉。稠朝阳￡机啪嘲融Ⅲl哦困§测疆。蝉剿鹱明ti：o,d遵吲Ⅲ躞；F嘲lsIl谚懒{3毽嘲躺射i洲莲多咿削髓：霉期pm羽t-融黼洲帮多盼瓢r耨l嗣唧Ⅲi简舞奠p4l；lI镶；息陲卺。i：目l瓣莲鞭莠鞲^I娃i灏¨￡一∞l：戢藉P糊斟l即^带i铡笼湖锄黉嘲撇剃§洲螗i溺；嘴e羽笋壮祧嘴限挎Ii测遵婶削黔攀剐§￡舯冁豹!勰睁《§醚秘潮a弘糍僦鲴嘲§瞪q脑鬟慷跏ol蝴I夔渤§：0蕊遵刚轴t鼬{iF啪龃舢露湖i0喇。l嘲Ⅲs01"降l笋㈣艚湖,el叩。一。州一0々皇日甙硼口曩薯嗣靖硼置o—Iz暑∞o置∞飘鼍。塑臣喇Q一再墨葺∞‘国毫口-o溜叻茸再目再hM_o—o-置oo目Q0甙．1葛．!I咪姆辖求自013害笛Qo盟糊牧僻咪椭苫宙。罨妒甙癸壬甙-￡匝辖求哒则投窨圜醐蝈僻啦球梢鼎窿眯罴刹髑# 华中农业大学2012届硕士研究生学位论文3．2．6Pathway显著性富集分析使用KEGG数据库，对差异表达基因进行分析，得到显著性富集数据见表3．8、3-9。Qvalue<0．05的Pathway在差异表达基因中显著富集，如表3．4、表3．5。在中双9号中，有4条Pathway显著富集，包括：氨基糖和核苷酸糖代谢、ABC转运、非同源末端连接、其他类型含氧糖的合成。在GH01中，有5条Pathway显著富集，包括：氨基糖和核苷酸糖代谢、ABC转运、苯丙氨酸代谢、丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢和光合作用。可以看到在中双9号和GH01中，氨基糖和核苷酸糖代谢、ABC转运均显著富集。表3-3中双9号中Pathway显著性富集数据表Table3-3ThesignificancebeneficiationPathwaydataofzhongshuang9Aminosugarand0．000nucleotidesugar129(1．76％)265(1．26％)1．86E一062318k000520metabolismABCtransporters72(0．98％)143(0．68％)8．60E-05Non-homologous14(0．19％)19(0．09％)0．0006160513end-joiningOthertypesof0·glycan22(0．3％)biosynthesis7650．00537210．02566880．034k002010k00345036(O．17％)0．0010989593424k00051468836 甘蓝型油菜耐湿差异性表达基凶的筛选及分析Aminosugarandnucleotidesugar120(1．76％)265(1．26％)6．65E-06ABCtransporters65(0．96％)143(0．68％)Phenylalanine97(1．43％)228(1．08％)0．0007459267metabolismAlanine，aspartateandglutamatemetabolismO．000837k0005209306O．027523O．027523O．02k0020lOk00036065(0．96％)144(0．68％)0．00087375967523k00025042740．02Photosynthesis51(0．75％)109(0．52％)0．001139764k00019587223．2．7荧光定量PCR使用Oligo软件设计基因特异引物(表2．5)，Ct值由仪器自动计算。在24个重要的具有GO功能注释的差异表达基因中挑选了8个基因进行实时荧光定PCR验证。这8个基因的功能注释如表3．5。分析基因的差异表达倍数并与华大基因测序结果进行比较。结果表明，这8个基因在淹水处理下的表达量改变倍数和表达谱测序中获得的差异表达倍数基本一致(图3-5)，说明基因表达谱测序结果真实可靠。37 华中农业大学2012届硕士研究生学位论文表3．5荧光定量PeR的差异表达基因Table3-5Candidategenesofquantitativereal-timePeR表达谱1092Ratio表达谱lo班荧光定量变化倍荧光定量变GeneID基因注释值(zhongshuangg)Ratio值数(zhongshuan99)化倍数(GH01)nine·-cis·-epoxycarotenoidBin021558dioxygenase31．63．1．3l2．29．O．31AP2domaincontainingproteinBra00370lRAP2．51．32．4．452．88一1．99Bral003701AP2domaincontainingproteinRAP2．51．32-4．452．65．2．11Bra014080hydrolase1．29一1．202．78．1．90glycosidehydrolasefamily28Bn0076091．19．1．123．61．2．22proteinBra016729glyeeraldehyde一3-phosphate2．051．892．672．3ldehydrogenase1Bra022115transcriptionfactor1．081．513．160．44Bra004778Stearoyl—acylcarrierprotein4．093．606．194．84desammse4讨论与小结4．1创新与不足本论文创新点有：利用转录组测序(RNA—seq)技术路线及方法，系统分析了中双9号和GH01实验 甘蓝型油菜耐湿差异性表达基因的筛选及分析组和对照组根系对淹水胁迫的响应，找出了大量耐湿相关基因，通过对这些基因的功能分类分析加深了对甘蓝型油菜湿害胁迫适应性调控机制的认识。本实验是首次从RNA水平上研究了甘蓝型油菜根系对湿害胁迫的响应，揭示了植物耐湿性是一个极其复杂的过程，为通过基因工程手段进行甘蓝型油菜耐湿育种提供了重要参考资料。不足之处主要有：实验组处理的时间点太少，只选取了处理12小时的材料。由于工作量和时间的限制，对鉴定的大量差异基因只能做些初步的分析。对可能具有重要功能的耐湿相关基因未能进行深入研究。4．2耐湿相关基因植物耐湿性是一个极其复杂的过程，涉及众多的代谢途径途径及大量的基因。在差异表达基因中，部分有功能注释的基因可能参与到耐湿调控，还有一部分是没有报道的基因，它们的差异表达原因及作用机制还不清楚，有待展开深入的研究。对这些基因的进一步研究，从而更深入了解甘蓝型油菜耐湿调控机制。中双9号特异性差异的3526个基因中，与GTP结合蛋白(GTP-bindingproteins)相关的基因有23个，其中GTP结合蛋白基因有6个。G蛋白的主要是通过偶联细胞表面受体receptor与其所调节的相应生理、生化活动而参与多种细胞信号转导过程(NeerEJ，1988)。在植物中G蛋白主要参与对生长激素、干旱及病菌胁迫的响应，及一些发育过程如侧根的形成、胚轴的生长及角果的发育等(LaetitiaPB，2004)。它在细胞跨膜信号传导中起着重要作用。在挑选的一些重要基因中，谷胱甘肽硫转移酶(GST)在中双9号上调，而在GH01中表现下调。并且都有明显的变化，说明GST是受淹水处理后表达的。有研究表明谷胱甘肽硫转移酶在逆境胁迫中有重要的调节作用(郑钧，2004)。因此，研究GST对探讨甘蓝型油菜对湿害胁迫的反应机理等方面有重要的意义。通过分析还发现了一些编码渗透调节物质的相关基因，这些基因都有明显的差异表达，如：甘氨酸／脯氨酸富集蛋白、ABC转运蛋白、转膜蛋白等，说明这些蛋白相关的基因在耐湿调控可能具有重要作用。在获得大量转录因子中，如锌指蛋白、DNA结合蛋白等都上调表达，而且每一个转录因子能调控多个基因的功能表达。因此增强或改良一个关键的转录因子的表39 华中农业大学2012届硕士研究生学位论文达和调控，可能提高甘蓝型油菜耐湿性。4．3结论随着生物技术的发展，植物抗逆性研究已从传统的植物生理方向转向分子水平的研究。目前己有很多与耐湿有关的基因被分离克隆，并利用基因工程，转入植物体内，提高了植物的抗逆性，这些都为抗逆新品种的筛选提供了良好的基础。本研究通过对耐湿品种中双9号与敏感材料GH01水淹12小时的表达谱测序，通过比较处理组与实验组的差异表达的基因，以及这些基因参与的生物代谢过程。并通过荧光定量验证测序结果的准确性。全文结论如下：1．湿害胁迫下中双9号和GH01中分别有12211个和11469个差异表达基因。其中，中双9号特异胜差异基因3526个，GH01特异性差异基因2784个，中双9号和GH01共表达差异基因8685个。2．对差异表达基因进行了主要生物学功能分类。在湿害胁迫下，在细胞组件中与细胞膜，细胞质，细胞器相关的差异基因占有很大比例。分子功能注释中的差异表达基因较多的是结合和催化相关基因，主要相关基因有：蛋白结合、阳离子结合相关基因、金属离子结合基因等结合基因，氧化还原酶、磷酸转移酶，水解酶等催化相关基因，转运载体、电子载体相关基因和一些参与信号转导的重要基因等。而在生物过程中主要是参与细胞内代谢途径的相关基因，如：蛋白代谢途径，糖代谢途径相关基因，分解代谢途径、细胞过程、刺激应答、生物学调节、细胞机构合成等相关途径的基因等。3．在中双9号中，有4条Pathway显著富集，包括：氨基糖和核苷酸糖代谢、ABC转运、非同源末端连接、其他类型含氧糖的合成。在GH01中，有5条Pathway显著富集，包括：氨基糖和核苷酸糖代谢、ABC转运、苯丙氨酸代谢、丙氨酸，天门冬氨酸和谷氨酸代谢和光合作用。4．应用Real-timeRT．PCR方法验证分析了8个基因，结果表明这8个基因在湿害胁迫下表达量改变倍数和表达谱测序中获得的差异表达倍数基本一致，从而表明测序数据真实可靠。 甘蓝型油菜耐湿差异性表达基因的筛选及分析参考文献1．曹铴，蔡士宾，朱伟，熊恩惠，方先文．国内外麦类作物耐湿性研究性．国外农学，1996，6(11)：48-49．2．程伦国，刘德福，郭显平，吴立仁，周淑芳．油菜排渍指标试验研究．湖北农业科学，2003(1)：37—39．3．陈洁，张学昆，堪利，晁国红，李加纳．甘蓝型油菜耐湿种质资源的快速筛选．中国油料作物学报，2006，28(2)：138-143．4．丛野，程勇，邹崇顺，张学昆，王汉中．甘蓝型油菜发芽种子耐湿性的主基因+多基因遗传分析．作物学报，2009，35(8)：1462—1467．5．范其新，张学昆，湛利，李加纳．缺氧环境对甘蓝型黄籽油菜与黑籽油菜发芽的影响．中国油料作物学报，2005(2)．6．金才，董琦，余叔文．不同生育期根际土壤淹水对小麦品种光合作用产量的影响．作物学报，2001，27(4)：434-442．7．刘后利．油菜的遗传和育种．上海：上海科学技术出版社，1985．8．卢长明，龚学明．缺氧条件下种子发芽特性的遗传参数研究．江西农业大学学报，1989，l1(4)：23—26．9．刘后利．实用油菜栽培学．上海：上海科学技术出版社，1997．10．林贤青，沈惠聪，季吟秋，周伟军．油菜渍害若干生理问题的探讨．浙江农业大学学报，1993(1)：19-23．11．吕军．渍水对冬小麦生长的危害及其生理效．植物生理学通报，1994，0(3)：221．12．刘林艳，吕长平，成明亮，莫宁捷．植物耐湿性研究进展．黑龙江农业科学，2008(2)：135-138．13．李真．甘蓝型油菜苗期耐湿性和抗旱性相关QTL分析．【硕士学位论文】．武汉：华中农业大学图书馆，2008．14．李真，蒲圆圆，高长斌，周广生，涂金星，傅廷栋．甘蓝型油菜DH群体苗期耐湿性的评价．中国农业科学，2010，43(2)：286．292．15．祁云霞，刘永斌，荣威恒．转录组研究新技术：RNA—Seq及其应用．遗传，2011，33(11)：1191·1202．16．魏凤珍，李金才，董琦．孕穗期至抽穗期湿害对耐湿性不同品种冬小麦光合特性41 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