三氧化二砷抑制腺样囊性癌acc-2细胞生长、诱导其凋亡的基因表达谱及其分子机制研究

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1、青岛大学博士学位论文三氧化二砷抑制腺样囊性癌ACC--2细胞生长、诱导其凋亡的基因表达谱及其分子机制研究姓名：姜涛申请学位级别：博士专业：眼科学指导教师：肖利华20120522目的三氧化二砷抑制腺样囊性癌ACC-2细胞生长、诱导其凋亡的基因表达谱及其分子机制研究博士生姜涛导师肖利华教授摘要本研究拟：(1)研究观察三氧化二砷(arsenictrioxide，As203)对腺样囊性癌(adenoidcysticcarcinoma，ACC)细胞株ACC．2细胞的生长抑制作用，探讨其诱导ACC．2细胞凋亡的作

2、阳机制。(2)检测As203药物作用前、后的ACC．2细胞的基因表达谱变化，筛选诱导ACC．2细胞凋亡的相关基因。(3)探讨凋亡相关基因bcl一2、c-myc在As203诱导ACC．2细胞凋亡中的作用，验证基因芯片的基因表达谱检测结果，探讨As203诱导腺样囊性癌ACC．2细胞凋亡的分子机制，为临床合理应用As203药物提供理论依据。(4)探讨hTERT在As203诱导ACC．2细胞凋亡巾的作用。(5)探讨线粒体膜电位(△vm)、Caspase3在As203诱导ACC一2细胞凋亡中的作用。材料与方法(

3、1)进行ACC．2细胞培养，将As203建立不同药物浓度梯度(0、1．0、2．0、4．0、8．0I，tmol／L)分别作用于ACC．2细胞，在倒置相差显微镜下动态观察培养板中不同浓度As203处理前后ACC．2细胞的形态变化，并照相记录；分别在药物作用后24h、48h、72h行MTT染色，酶标仪测得吸光度OD值，计算细胞生长抑制率：行Hoechst33342／PI双染免疫荧光染色，AnnexinVoPI双染行流式细胞术分析细胞凋亡率，PI染色行流式细胞术检测DNA含量与细胞周期：用透射电子显微镜观察A

4、s203作用于ACC．2细胞前后的细胞超微结构变化。(2)应用基因芯片技术检测As203药物作用前、后的ACC．2细胞的基因表达谱变化，运用生物信息学分析差异基因的功能网络，获得显著表达差异的候选基因。(3)应用RT-PCR和WesternBlot方法，检测As203作用前、后，ACC．2细胞的凋亡相关基因bcl．2、c．myc的mRNA水平和蛋白水平的表达。(4)应用RT-PCR方法，检测As203作用前、后，ACC．2细胞的hTERT的mRNA水平表达。(5)用Rhl23染色，流式细胞仪检测8．0

5、阻nol／LAs203作用前、后(24h)，ACC．2细胞的线粒体膜电位(△vm)变化；用多功能酶标仪进行Caspase3活性检测。结果(1)As203可抑制腺样囊性癌ACC．2细胞生长，且抑制作用呈现时间．剂量依赖关系；免疫荧光染色观察到随As203药物浓度增高，作用时间延长，细胞核被染成强蓝色的凋亡细胞越来越多；透射电子显微镜下的超微结构观察结果，可见ACC．2细胞有部分呈现凋亡的形态，细胞体积缩小，细胞核浓聚缩小，核内出现透明区，核仁消失，核空泡化，染色质固缩，聚集于核膜下，染色质或凝集成团块状

6、部分并附着在核膜下，或染色质边聚，形成新月状，细胞器减少，细胞浆浓缩，或裂解成质膜包绕的染色质碎片(凋亡小体)；流式细胞术结果显示，随As203药物作用浓度的增加，ACC．2细胞的凋亡率逐渐增高：除低浓度组(1．09mol／L)外，其余药物浓度组(2．0、4．0、8．09mol／L)与对照组相比，其差异有显著性(P<0．05)：药物作用组均可检测到亚Gl期凋亡峰，但低浓度组(1．0、2．09rnol／L)的凋亡峰不明显，高浓度组(4．0、8．09rnolfL)的亚Gl期凋亡峰明显；4．0、8．09mo

7、l／L的AS203作用48h后，ACC．2细胞G2．M期细胞数明显增多，与对照组相比，分别上升30．23％和33．43％。(2)As203作用于ACC．2细胞后，其基因表达谱发生了较大的变化，有1160个基因显著上调表达；1084个基因显著下调表达。(3)RT-PCR结果显示，在未经药物作用、作为对照组的正常培养的ACC．2细胞中，bcl一2、c—myc的mRNA呈现明显高表达；在As203作用于ACC．2细胞后24h与48h时，随As203药物浓度的增高(1．09mol／L、2．09mol／L、4．

8、09mol／L、8．09mol／L)，bel一2、c—myc的mRNA表达逐渐降低。WestemBlot结果显示，在未经药物作用、作为对照组的正常培养的ACC．2细胞巾，bcl．2、c．mye蛋白呈现明显高表达；在As203作用于ACC．2细胞后24h与48h时，随As203药物浓度的增高(1．09mol／L、2．09mol／L、4．0pmol／L、8．0umol／L)，bcl．2、c．myc蛋白表达逐渐降低，与mRNA表达变化趋势相一致。(4)RT-P