三氧化二砷对骨髓瘤细胞系u266抑制增殖及诱导凋亡的机制研究

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1、三氧化二砷对骨髓瘤细胞系U266抑制增殖及诱导凋亡的机制研究【摘要】本研究探讨三氧化二砷（As2O3）在体外对骨髓瘤细胞系U266的生物学效应及其机制。用MTT法观察As2O3对U266细胞增殖的影响，用流式细胞术、DNA凝胶电泳法分析As2O3对U266细胞凋亡的影响，以RTPCR法检测2μmol/LAs2O3不同处理时间对U266细胞人端粒酶逆转录酶蛋白催化亚单位（hTERT）mRNA的表达变化，用echanismsUnderlyingtheEffectofArsenicTrioxideonProliferat

2、ionInhibitionandApoptosisInductioninMyelomaCellLineU266AbstractTheaimofthisstudyechanismsunderlyingeffectofarsenictrioxide(As2O3)onmyelomacelllineU266invitro.TheviabilityandapoptosisofU266cellsetryandDNAagarosegelelectrophoresis.TheexpressionofhTERTmRNAol/L.Aft

3、ertreatmentol/LAs2O3at24,48and72hours,adoseandtimedependentapoptosisofU266cellscouldbeobserved.AftertreatingU266cellsol/LAs2O3atdifferenttimepoints,atimedependentreductionofprocaspase3,hTERTmRNAandprotEInitochondrialtransmembranepotential,initiatingthemitoc

4、hondialapoptosispathyeloma;U266cell;cellsapoptosis;caspase3;hTERT多发性骨髓瘤（multiplemyeloma,MM）是一种以骨髓中单克隆浆细胞恶性增殖并分泌大量单克隆免疫球蛋白为特征的浆细胞肿瘤，多引起广泛骨质破坏、反复感染、贫血、高钙血症、高粘滞血症、肾功能不全等一系列临床表现。目前，MM仍无法治愈。近几年来国内外研究报道，三氧化二砷（As2O3）在复发和难治性MM的治疗中取得了可喜的疗效。相关基础研究也发现，As2O3在体外通过使细胞周期蛋白依赖

5、性激酶抑制因子P15、P16和P21重新表达或表达增强，下调癌基因cmyc的表达以及影响黏附分子表达等多种机制影响骨髓瘤细胞增殖周期，促进其凋亡并影响其归巢。但是，As2O3对骨髓瘤细胞的作用机制尚未完全清楚［1-6］。因此，我们以骨髓瘤细胞株U266为体外模型，探讨As2O3对骨髓瘤细胞的作用及相关机制。材料和方法材料和试剂As2O3为黑龙江伊达药业公司产品，用注射用水稀释至1×103μmol/L的储存液，使用时用RPMI1640培养液稀释至工作浓度。MitoCaptureMitochondrialApoptos

6、isDetectionKit购自美国Biovision公司。实验中使用的单克隆抗体及二抗均购自SantaCruzBiotechnology公司。骨髓瘤细胞株U266由上海第二军医大学附属长征医院血液科侯健教授惠赠。U266细胞培养于含10％胎牛血清的RPMI1640培养液中，在37℃、5％CO2、饱和湿度的孵箱中培养。取对数生长期细胞用于实验。As2O3对U266细胞生长影响的MTT法检测将不同浓度As2O3处理48小时及一定浓度的As2O3处理不同时间后的样本置于酶标仪上检测波长492nm的吸光度，每组设6个平行孔

7、，以对照组（0μmol/L）细胞增殖率为100％，按下述公式计算细胞增殖率。细胞增殖率（％）＝（药物组OD492/对照组OD492）×100%细胞凋亡的DNA凝胶电泳检测调整U266细胞浓度至2×105/ml，加入As2O3使终浓度为2μmol/L，作用0、24、48、72小时后，将5×105细胞移入无菌的1.5mlEppendorf管中，4℃2000r／min离心5分钟，弃上清。加入20μl溶解缓冲液，用移液管尖混匀细胞沉淀。加10μlRNA酶A(500U/ml)，轻弹管尖混匀。37℃孵育90分钟。加10μl蛋白酶

8、K(20mg/ml)，轻弹管尖混匀，50℃孵育过夜。样品于20g/L琼脂糖凝胶，25V，电泳3小时后，在凝胶成像系统中成像观察。细胞凋亡的流式细胞术检测收集细胞用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液接种于25ml培养瓶，细胞浓度为2×105/ml，加入As2O3使终浓度为2μmol/L和5μmol/L，空白对照组只含培养液，处理0、24、4