toll样受体myd88和trif信号因子在乳腺癌中的表达与意义

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1、重庆医科大学博士学位论文TOLL样受体MyD88和TRIF信号因子在乳腺癌中的表达与意义姓名：唐乐辉申请学位级别：博士专业：外科学指导教师：任国胜201204重庆医科大学博士研究生学位论文TOLL样受体MyD88和TRIF信号因子在乳腺癌中的表达与意义研究背景摘要作为居女性恶性肿瘤死亡原因之首的乳腺癌，确切证据表明，90％以上的患者最终死于肿瘤转移或复发，乳腺癌的复发和转移是影响其疗效的主要因素。探讨导致肿瘤侵袭和转移的致病因素因此显得非常重要。因为乳腺癌是复杂的病理学本质的异质性疾病，所以预测肿瘤远端转移比率的发生还是非常困难的。就因于此，寻找乳腺癌增殖、迁移运动和转移

2、有关的新的预后因素相关的分子生物学标记物在应对乳腺癌的复发和转移有积极意义。诸多的研究证实，炎症与癌症具有密切相关性，而持续性的炎症能诱导癌症的产生。细胞因子和化学因素在增加血管发生、转移和特异性免疫下调中发挥决定性作用。长期慢性炎症刺激能够引起肿瘤组织释放许多诱发肿瘤本身生长的因子，这样形成了一个炎性微环境，促进了肿瘤的发生与发展。并且一旦炎症刺激肿瘤细胞释放多种免疫因子后，我们很难再次诱导肿瘤细胞凋亡。可见，炎症因素能够诱导肿瘤细胞抵抗凋亡。Toll样受体(Tollikereceptors，TLRs)的深入研究是近年在先天免疫研究方面的卓越发展。一般情况下，TLRs能

3、够被激动剂激活，重庆医科大学博士研究生学位论文分别通过两个下游途径即MyD88依赖性和非依赖性即TRIF途径启动下游信号转导，形成系列反应。有研究提示TLRs的表达与乳腺癌之间呈现较强烈的关系，在乳腺癌中部分TLRs表达与雌激素受体呈负相关，说明TLRs的表达水平在临床对乳腺癌侵袭和转移的诊断中可能发挥重要作用，但TLRs介导的入侵的病理生理学机制还不明确。研究目的本研究在收集如病人的年龄、淋巴转移率、肿瘤大小、TNM病理分期等临床数据后，并通过基因、蛋白、形态学的检测，观察TLR受体下游相关信号的表达分布、变化特点，以及TLRs信号因子MyD88和TRIF表达特点与肿瘤

4、特性之间的相关性。同时，试图从体外细胞研究中，了解MyD88和TRIF对乳腺癌生物学特征的影响及分子机制进行探讨。方法1．I临床资料经患者知情同意，随机收集乳腺癌改良根治手术且临床资料完整的患者标本，经病理确诊。所有患者术前均未接受放、化疗。均为女性，平均年龄52(38--一72)岁，其中绝经前20例，绝经后15例。病理类型以乳腺浸润性导管癌为主，仅1例为粘液腺癌及1例髓样癌。依照国际乳腺癌TNM分期分为：I期1例，II期26例，III期8例。组织学分类：早期浸润性导管癌1例，浸润性非特殊性癌32例，浸润性特殊性癌2例。5重庆医科大学博士研究生学位论文2．免疫组织化学染色

5、乳腺癌肿瘤组织及其癌旁正常组织切片，进行常规脱蜡、梯度脱水、抗原热修复后，3％过氧化氢以消除内源性过氧化物酶；滴加山羊血清封闭。甩干血清直接滴入兔抗MyD88和TⅪF抗体，4℃孵育过夜。PBS清洗，滴加山羊抗兔二抗。37℃，40min，PBS清洗，加生物素卵白素复合物。显色、脱水、透明、封片。每张切片随机选取3．5个高倍视野(X400)采图，图像分析。3．免疫组化结果判定细胞阳性染色表现在细胞核或细胞质，颜色为棕黄色颗粒定为阳性信号。阳性结果判断：①阳性细胞的百分比：<1咿O；1％～10％---1；>10％，≤30％F2；>30％，≤60忙3；>60炉4。(多阳性细胞的染

6、色强弱：阴性=O；淡黄色=1；黄色=2；棕黄色=3。①+②即为标本的免疫组化评分：0～2分(阴性)，3～7分+(阳性，+++即强阳性)。4．提取总RNA以及RT-PCR检测按照Trizol试剂说明书和逆转录试剂盒说明书介绍的步骤提取组织总RNA，以及进行后继的反转录过程基因合成。产物用1．4％(含goldview)琼脂糖凝胶电泳和染色。使用紫外光凝胶照像，经Image软件进行灰度测定，实验重复3次。把MyD88和T砌F的灰度值与内参GAPDH灰度值的比值进行统计、分析。5．Westernblot表达检测取出收集置一80℃保存备用的临床标本，使用蛋白裂解试剂进行裂解，然后进

7、行蛋白浓度定量确定待测样品的浓度。在胶凝固后，6重庆医科大学博士研究生学位论文加入上样组织，120V电泳。用PVDF膜进行转膜、加入兔抗MyD88和TRIF一抗，4℃过夜、二抗杂交后显色，拍照。6．细胞培养与转染选用人乳腺癌MCF7细胞，使用含10％新鲜胎牛血清的DMEM培养基，37。C年D5％C02的条件培养。后采用MyD88和T砒FsiRNA慢病毒转染肿瘤细胞，转染后观察细胞的生长状态并对转染后的细胞进行MyD88和TRIF基因和蛋白表达检测。7．MTT法检测细胞增殖分别将MyD88和T刚F慢病毒转染组后的细胞和对照组细胞