p-gp介导的阿米替林与去甲替林中枢相互作用的体外与体内研究

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1、分类号UDC博士学位论文密级P-gp介导的阿米替林与去甲替林中枢相互作用的体外与体内研究ThestudyofP—·glycoproteinmediatedamitriptylineandnortriptylineinteractionsincentralnervonssystem／nvitroand／nvivo作者姓名：学科专业：学院(系、所)：指导教师：论文答辩日期≯。I)j、2留刘艺平药理学药学院李焕德教授答辩委员会主席中南大学二。一二年五月原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了

2、论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：日期：鲨年』月垫日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，

3、并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：导师签弛期：坐年上月盗日簋±堂位论塞生塞擅要摘要目的：考察地塞米松与维拉帕米对P一糖蛋白(P—gP)功能及表达影响的时效与量效关系及其对阿米替林与去甲替林外排速率及中枢分布的影响；评估P—gp介导的体外相互作用与脑内相互作用的相关性，探讨利用P—gP介导的相互作用促进药物疗效与减少不良反应的可行性。方法：1．采用HaloC18(2．1mm×100mm，2．7Imp)色谱柱，纯净水-乙腈(v／v，60：40)为流动相，采用WatersMicromassQuattroPremierXE二极质谱仪为检测器，

4、建立UPLC．MS／MS同时测定阿米替林与去甲替林含量的方法。2．Caco一2细胞采用MEM培养基进行常规培养，P．糖蛋白表达通过荧光免疫法验证；采用MTT法考察维拉帕米和地塞米松对Caco．2细胞活性的影响；使用流式细胞术考察地塞米松、维拉帕米对罗丹明123摄取的影响。使用免疫荧光与流式细胞术研究地塞米松、维拉帕米对P．糖蛋白表达的影响。3．将Caco．2细胞接种于transwell板进行培养，构建单层细胞模型，用细胞电位仪、萤光黄及普奈洛尔转运实验对模型进行验证。建模成功后考察地塞米松、维拉帕米对阿米替林与去甲替林的双向跨膜转运的影响。4．

5、396只昆明种雄性小鼠被随机分成3组，经单次或多次给药后，研究地塞米松与维拉帕米对阿米替林与去甲替林中枢转运的影响。结果：1．在实验条件下，地塞米松、维拉帕米及内标物质分离良好，色谱峰尖锐且半峰宽小于0．25s。一次进样的运行时间小于4min。最低检测限为10ng·mL～。阿米替林与去甲替林在10-----2500ng·mLJ浓度范围内线性良好，方法准确、灵敏、简单。2．Caco．2细胞经复苏后培养成功，荧光免疫法证实了Caco．2细胞中P．糖蛋白强表达。MTT法证实地塞米松、维拉帕米浓度小于100pmol·L。1时，对细胞活性无影响。Rh．1

6、23的摄取实验发现在O．01～25pmol·L。1范围内，与空白对照组相比，地塞米松组降低了细胞内荧光强度，降低的幅度为10～60％，荧光强度与浓度呈负相关；而维拉帕米增强了细胞内荧光强度(浓度>0．1pmol·L。)，荧光强度的增加与剂量正相关。免疫荧光实验发现，在1"---501amol-L。1浓度范围内，地塞米松组荧光强度显著强于空白对照组(P

7、维拉帕米浓度为O．01gmol·L。时，对P—gp表达无影响。3．显微镜下显示Caco．2单层细胞排列紧密且完整，荧光黄及普萘洛尔跨膜实验证实细胞旁路转运通透性低，而跨细胞转运通路通透性良好。跨膜转运实验证实了阿米替林与去甲替林是P—gP的弱型底物，地塞米松增加了阿米替林和去甲替林的外排速率(增加幅度为10％'---'60％)，而维拉帕米减少了阿米替林和去甲替林的外排速率(减少幅度为10％'---'20％)。4．在体动物实验表明地塞米松能减少阿米替林与去甲替林脑组织浓度一时间曲线下面积(AUC)值，减少程度大约为40～50％，而维拉帕米能增加阿

8、米替林与去甲替林AUC值，增加程度大约为10％-～50％。结论：地塞米松能增强P．糖蛋白的功能，同时诱导其表达，增加了阿米替林与去甲替林的外排速率，减