neuregulin-1β对缺血再灌注损伤后大鼠视网膜的保护与对热休克蛋白70表达的影响

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1、第一章材料与方法1．1主要试剂和仪器设备1．1．1试剂Neuregulin一1B(纯度>97％)美国Morehouseschoolofmedicine浓缩型HSP70一抗北京中山生物技术有限公司生物索化马抗鼠IgG北京中山生物技术有限公司辣根酶标记链酶卵白素工作液北京中山生物技术有限公司DAB显色试剂盒武汉博士德生物工程有限公司苏木精、无水乙醇、二甲苯、水合氯醛等均为国产分析纯试剂1．1．2主要仪器设备微量移液器显微照相装置Image—propl[IS图像分析系统石蜡切片机电热恒温培养箱17L机械型微波炉手术器械1-1．3其它法国Gilson公司同本01ympus公司美国MediaCyber

2、netiCS公司美国Lambert公司上海跃进医疗器械一厂广东顺德市电器实业有限公司青岛大学医学院附属医院眼科、脑科研究所国产704硅橡胶、日本产2．0钓鱼线(直径0．23)、外科用尼龙缝线、游标卡尺1．2实验动物及分组健康无眼疾的成年Wistar大鼠32只(青岛市药检所提供)，体重220-2509，雌雄不限，室温环境下饲养，随机分为币常组(1只)、假手术组(1只)、对照组(15只)及实验组(15只)。后2组再根据灌注时间不同分为1h、6h、12h、24h、72h组。对照组于再灌注开始时玻璃体腔注入5uL平衡盐溶液，实验组再灌注开始时玻璃体腔注入5pLNRG一1B(纯度>97％)(美国Mor

3、ebouseSchoolofmedicine)，假手术组只分离暴露颈内动脉，j下常组未作任何处理。1．3动物模型的制备及药物干预方法1．3．1模型制备010％71㈣(300rng／kg)腹腔注射麻醉大鼠，259／L碘付消毒2青岛人学硕十学位论文颈部皮肤，颈旁偏左0．3～O．5eTa作长约2cm纵行切口，钝性分离出颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉；②丝线结扎颈外动脉远心端，动脉央央闭颈总动脉近心端、颈内动脉远心端，并在颈外动脉靠近颈总动脉处预置一根缝线；③显微剪刀靠近颈外动脉结扎处近心端剪一斜口，插入线栓，打结预胃缝线，不必太紧，剪断颈外动脉结扎处，向下逆转动脉，使之与颈内动脉成一直线；④松丌颈总

4、、颈内动脉央，同时用显微镊子向颈内动脉输送线栓到达标记点即可；⑤此时外观可见大鼠左眼苍白，与右眼成明显对比，眼底镜F可见左眼视网膜水肿；⑥将线栓头退至颈总动脉分叉处可见左眼巩膜重新恢复血供，视网膜血管充盈，造模成功。1．3．2药物干预在缺血完毕恢复再灌注伊始，用微量注射器抽取5pLNRG一113，由左眼耳侧角巩膜缘进入玻璃体腔依次注入实验各组，将针头停留约15s再拔出，以防止药液渗漏。同理，将抽墩的同体积平衡盐溶液注入对照组。1．4标本采集与制备1．4．1标本采集根据手术各组不同再灌注时l’Bj，分别与再灌注后lh、6h、12h、24h、72h深麻醉大鼠后摘除左眼球，沿角膜缘做切口，去除晶状

5、体，10％中性甲醛固定，时问>24小时。1．4．2蜡块的制作1)已固定标本自来水冲洗3次。2)标本置于85S乙醇过夜。3)标本置于95％乙醇I1小时。4)标本置于95％乙醇II小时。5)标本置于无水乙醇11．5小时。6)标本置于无水乙醇111．5小时。7)标本置于丙酮1小时，60。C烘箱。8)标本置于二甲苯10．5小时，60℃烘箱。9)标本置于二甲苯110．5小时，60℃烘箱。lo)60℃浸蜡1小时包埋。11)冷却、4。C冰箱保存备用。1．4．3切片、展片、粘片3第一章材料与方法修诈蜡块，调节石蜡切片机刻度指针为5帅，每一标本沿视轴方向纵向连续切片7张，两张用于普通HE染色，另外五张用于免疫

6、组织化学的HSP70检测。切片分别至于60℃温水漂复展平，平铺于涂有多聚赖氨酸的载玻片上，入40℃烤片箱约10余分钟烘干。1．5切片染色1．5．1普通HE染色将烤好的切片先后经二甲苯I脱腊5分钟一二甲苯II脱腊5分钟一无水乙醇2分钟一95％乙醇2分钟一90％乙醇2分钟一80％乙醇2分钟一水化一自来水冲洗5分钟一入明矾苏木精液染色2分钟一自束水冲去浮色10秒钟一1％盐酸酒精分色40秒钟一氨水反蓝一自来水冲洗10分钟一80％乙醇2分钟一0．5％伊红复染1分钟一95％乙醇2分钟一无水乙醇I2分钟一无水乙醇112分钟一石炭酸2分钟一二甲苯I2分钟一二甲苯II2分钟一中性树胶封片一入42℃烤片箱烘烤2

7、4小时即成片，入切片盒保存备用。1．5．2HSP70检测1)石蜡切片入电热恒温培养箱60。C过夜。2)切片入二甲苯I15分钟，再入二甲苯II15分钟充分脱蜡。3)切片依次放入梯度酒精各2分钟，分别为无水乙醇I、无水乙醇II、95％乙醇、80％乙醇和70％乙醇，最后流水冲洗lO分钟。4)新鲜配置的3％H：Q，室温灭活内源性过氧化物酶10分钟，蒸馏水洗5分钟×3次。5)在微波炉里加热0。01M枸橼酸钠缓冲溶液(p